COVID-19 REDLARA: LIvros (Reprodução Assistida)
Capacitação Espermática
As técnicas de reprodução assistida agem no tratamento da infertilidade conjugal pelo manuseio e transferência de gametas e embriões para o trato genital da mulher. Assim sendo, a coleta, o preparo e a obtenção desses "agentes terapêuticos" merecem cuidados especiais. A coleta do sêmen é realizada através de masturbação, após um período de abstinência sexual de 3 a 5 dias. Esta é a forma corrente de obtenção do esperma, entretanto, quando não há condições para esse procedimento, outros métodos são empregados (estimulação elétrica ou vibratória direta sobre a próstata ou pênis, punção das vias espermáticas, biópsia do testículo, coleta e isolamento de espermatozóides na urina). Por outro lado, os espermatozóides de mamíferos necessitam sofrer modificações funcionais e estruturais para fertilizarem os oócitos. Habitualmente, o conjunto destas transformações é definido como capacitação espermática (Austin, 1952). Originalmente, acreditava-se que estas mudanças ocorreriam apenas quando os espermatozóides estivessem em contacto com o trato genital feminino. Do ponto de vista fisiológico, essas alterações deveriam ser progressivas desde que os espermatozóides gastam um tempo para atingirem as trompas e iniciarem sua interação com os oócitos. Precocemente, adquirir a capacidade de fertilizar poderia ser um problema (Bedford e Chang, 1983). Todavia, subseqüentes estudos mostraram que se pode obter capacitação "in vitro" dos espermatozóides na presença de fluidos biológicos ou simples meios de cultura (Chang, 1951). Em geral, os espermatozóides capacitados são aqueles que apresentam reação acrossômica. Inicialmente, essas modificações ocorrem ao nível molecular da membrana plasmática e resultam em alterações morfológicas (reação acrossômica) e fisiológicas (hiperativação do flagelo). A reação acrossômica é caracterizada pela fusão entre a membrana plasmática e a acrossomal externa, resultando em formação de vesículas e permitindo a liberação de enzimas do conteúdo acrossômico (Figura 4.1). Os espermatozóides necessitam reagir com componentes dos oócitos (células do "cumulus", fluido folicular, zona pelúcida) para completarem a reação acrossômica. O processo de capacitação depende de alterações da permeabilidade da membrana ligadas ao transporte dos íons Ca++. A modulação do íon cálcio é fundamental para os espermatozóides adquirirem a capacidade de fertilização tendo esse processo 3 aspectos fundamentais :1 - a presença de uma TPA se capaz de bombar o Ca++ para fora da célula. 2 - o processo de troca de Ca++ (exterior) com Na+ para o interior. 3 - canais de cálcio que facilitariam a rapidez de fluxo (Fraser, 1994). Por outro lado, existem várias evidências que sugerem a necessidade da presença de Ca++ no meio extracelular. Fraser (1982) tratou os espermatozóides com Ca++ ionóforo A23187 na presença de Ca++ extracelular, observando uma rápida passagem de Ca++ para dentro da célula, tal fato é acompanhado de exocitose da região acrossômica. Por outro lado, com o sucesso da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) ficou estabelecido que a reação acrossômica não é pré-requisito para o núcleo do espermatozóide participar no processo meiótico (Liu e cols., 1995). A hiperativação caracteriza-se por mudanças no padrão do batimento flagelar, fato que facilitaria a penetração dos espermatozóides através dos diversos envoltórios dos oócitos. Além das diversas técnicas de preparo do esperma, fatores biológicos e farmacológicos poderiam ser usados para melhorar a qualidade do esperma em laboratório. Freqüentemente, o soro humano é empregado para enriquecer o meio de cultura após inativação na temperatura de 56º C por 45 minutos. Acredita-se que este procedimento aumentaria a sobrevida dos espermatozóides, assim como a taxa de fecundação e gravidez nos casos de oligoastenozoospermia (Makler e cols., 1980). Diversos trabalhos, porém, relataram que o fluido folicular age sobre os espermatozóides de modo significativo, elevando sua motilidade, o poder de penetração nos oócitos de hamster e a taxa de fertilização dos oócitos humanos em cultura "in vitro" (Delgado e cols., 1987; Mortimer e Camenzind, 1989; Ghetler e cols., 1990; Chao e cols., 1991). Da mesma maneira, a adição de fluido folicular humano melhoraria a motilidade dos espermatozóides e a taxa de gravidez após inseminações intra-uterinas (Blumenfeld e Nahhas, 1989; Mbizvo e cols., 1990). Na mesma linha de pensamento, Franco Jr. e cols. (1994) não observaram diferenças significativas entre a taxa de formação embrionária (total de embriões obtidos / total de oócitos inseminados) quando os espermatozóides foram capacitados com (tempo de incubação curta ou lenta) ou sem fluido folicular. Diferentemente, Revelli e cols. (1995) observaram que o fluido folicular e uma mistura de fluido folicular e peritoneal (mas não o fluido peritoneal isolado) podem induzir uma rápida reação acrossômica. Os derivados da metilxantina (cafeína, teofilina, pentoxifilina) possuem a propriedade de estimular a motilidade progressiva espermática pois inibem a adenosina cíclica 3'-5' monofosfato (AMP) fosfodiesterase levando a um aumento intracelular das concentrações de cAMP (Bunge, 1973; Yovich e cols., 1988). Fuse e cols. (1993) observaram que a pentoxifilina induziu "in vitro" um aumento da motilidade espermática, com aumento da velocidade e da amplitude do deslocamento lateral da cabeça dos espermatozóides, fato observado até 120 minutos do início da incubação. Em linhas gerais, os procedimentos laboratoriais de preparo e capacitação dos espermatozóides podem ser divididos nos seguintes métodos :A - Migração. B - Sedimentação-migração ou "swim-up". C - Separação por gradientes de densidade.
Métodos de Migração
Migração ascendente
O método de migração ascendente ou vertical é a mais simples técnica de preparação espermática, também é chamado de camada. O esperma liquefeito é depositado na parte inferior de um tubo contendo um volume de meio de cultura (Menezo B2, GPM, IVF-50, etc). Em seguida, incuba-se na temperatura de 37º C por um período de 45 a 60 minutos, permitindo, dessa forma, a migração dos espermatozóides para o meio. Em seguida, 80% da parte superior do meio de cultura é retirada e os espermatozóides obtidos usados para as técnicas de reprodução assistida. Rotineiramente, o meio de cultura é enriquecido com soro inativado da paciente a 30% e um volume de 1.5 ml é colocado em tubo de Falcon. Em seguida, deposita-se no fundo do tubo sob o meio, cerca de 1.0 ml de sêmen liquefeito. Incuba-se por 45 minutos à 37º C em atmosfera de CO2 a 5% (exceto para a técnica de inseminação). Após esse período, retira-se o sobrenadante que é centrifugado em 200 g por 5 minutos. Posteriormente, dilui-se o sedimento obtido com 1 ml de meio e repete-se a centrifugação nas condições citadas. Finalmente, o segundo sedimento obtido é ressuspenso no volume desejado. (Figura 4.2). Em caso de fertilização "in vitro" (FIV), retirar o sobrenadante sob o segundo sedimento e adicionar 0.5 ml de meio enriquecido com soro inativado da paciente a 30%. Incubar durante 15 minutos à 37º C. Retirar 0.4 ml do sobrenadante e transferir para novo tubo de Falcon, após o que uma alíquota de 10u l é depositada numa câmara de Makler para avaliação da concentração e motilidade dos espermatozóides.
Migração ascendente-sedimentação
Tea e cols. (1983) descreveram um método de migração ascendente e sedimentação numa câmara especial (Figura 4.3). Lucena e cols. (1989) empregando este método para capacitação dos espermatozóides em procedimentos de FIV conseguiram fecundação oocitária em 85% dos pacientes com normozoospermia. As amostras não apresentaram espermatozóides imóveis, morfologicamente anormais, imaturos, demais células ou debris. O método de capacitação espermática através da migração scendente-sedimentação requer a utilização de câmara de Tea-Jondet-Scholler. Dessa forma, um volume de 1.5ml de meio de cultura enriquecido com 30% de soro inativado da paciente é depositado na parte interna e externa da câmara. Em seguida, 0.2ml do sêmen liquefeito é depositado nas laterais de fora da câmara e após um período de incubação de 2 horas `a 37º C, retira-se 0.3ml do fundo do cone central da câmara. Em seguida, a concentração e motilidade dos espermatozóides é analisada, acertando-se a concentração conforme a técnica de reprodução assistida indicada.
Métodos de sedimentação-migração ou "swim-up"
O método tradicional de sedimentação-migração é chamado de "swim-up". Recentemente, certas críticas foram levantadas sobre a técnica de "swim-up", pela detecção da presença de radicais superóxidos nos sedimentos formados após as centrifugações (Aitken e Clarkson, 1988). Tal fato, ocorrendo antes do processo de migração, acarretaria lesões irreversíveis das membranas plasmáticas dos espermatozóides, basicamente compostas por fosfolípides e sensíveis à ação destes radicais oxidantes, prejudicando o futuro processo de capacitação. A técnica de "swim-up" é usada nos programas de reprodução assistida, especialmente quando o espermograma prévio foi considerado normal. Nessa situação, geralmente há uma alta proporção de espermatozóides móveis, morfologicamente normais, ausência de massas citoplasmáticas anucleadas e debris, sendo os níveis de fertilização excelentes, especialmente em FIV convencional. Os problemas de fertilização com o "swim-up" surgiram quando se trabalhou com amostras de sêmen ricas em espermatozóides anormais, mortos, debris, restos celulares, neutrófilos, macrófagos, etc. Na sedimentação-migração, o esperma liquefeito é distribuido em vários tubos e lavado com meio de cultura suplementado com soro inativado da paciente a 30%, na proporção de 2 ml de meio para 1 ml de sêmen. Em seguida, executa-se duas centrifugações consecutivas em 200 g por 5 minutos, sempre com subseqüente eliminação do sobrenadante. Após o que, um volume de meio de cultura é cuidadosamente depositado sobre o sedimento resultante da última centrifugação, sendo incubado pelo tempo de 45 a 60 minutos `a 37º C em atmosfera de C02 a 5% (exceto para a técnica de inseminação), para permitir a migração dos espermatozóides. Após esse período, retirar o sobrenadante, analisar a concentração e motilidade dos espermatozóides recuperados e acertar a concentração dos espermatozóides conforme a técnica de reprodução assistida indicada (Figura 4.4).
Métodos de separação por gradientes de densidade
Atualmente, o método de gradientes de Percoll é um dos mais utilizados, aumentando a recuperação e porcentagem de espermatozóides móveis, especialmente nos casos de oligoastenozoospermia. Em 1981, Gorus e Pipeleers empregaram o Percoll pela primeira vez na separação espermática. Esse método consiste de uma filtração dos espermatozóides através de gradientes com diferentes densidades de Percoll, de forma que nas camadas de densidades inferiores são retidos os espermatozóides imóveis e componentes celulares do plasma seminal, nas camadas de densidade superiores permanecem os espermatozóides móveis. Geralmente, o gradiente descontínuo de Percoll é preparado através de uma sequência de pipetagens das frações 100%, 90%, 70%, 60% e 40%, sendo o esperma liquefeito depositado no topo da coluna que é centrifugada por cerca de 20 a 30 minutos de 300 g a 600 g . As frações 40%, 60%, 70% contém o plasma seminal, espermatozóides imóveis e outras células, enquanto que as demais frações, onde se encontram os espermatozóides móveis são diluídas com meio de cultura e centrifugadas para eliminar o Percoll. Diversos pesquisadores simplificam ao máximo este método propondo o uso de gradientes com um menor número de frações de Percoll (Tredway e cols., 1990; Van der Zwalmen e cols., 1991). Por outro lado, Ord e cols. (1990) indicaram uma redução no número (50%, 70%, 95%) e volume (0.3ml) das frações de Percoll (Mini-Percoll) em casos de oligoastenozoospermia (menos que 5 x 106 espermatozóides móveis por ml) e relataram uma fertilização em 40% dos oócitos inseminados "in vitro" contra apenas 7% no grupo controle (swim-up). No Centro de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá Junqueira usa-se o método dos gradientes de Percoll da seguinte forma : 1 - Prepara-se uma solução isotônica de Percoll (SI) com 9 ml de Percoll mais 1 ml de Ham F-10 (10 x concentrado). Ajusta-se a osmolaridade para 280 mOsm/Kg H20. Em seguida, adiciona-se penicilina na dose de 60 mg/l. Filtra-se a solução em 0.22 m sendo estocada até 30 dias `a 4 C. 2 - O preparo dos gradientes de Percoll é realizado com as seguintes diluições (Figura 4.5) : A. Solução 90% : 1.35 ml de SI + 0.15 ml de meio de cultura com 30% de soro inativado (MC-30). B. Solução 40% : 0.6 ml de SI + 0.9 ml de MC-30. Assim sendo, coloca-se 1.5 ml dos diferentes gradientes em tubo cônico de 15 ml (Corning). Acima do gradientes de 40%, deposita-se um volume até 3 ml de sêmen liquefeito. Centrifuga-se em 200 g por 20 minutos, no caso de amostras viscosas aumenta-se o tempo de centrifugação. Após a centrifugação remove-se o plasma seminal e a camada do gradiente de 40%. Finalmente, lava-se o sedimento formado no fundo do tubo e a camada correspondente ao gradiente de 90% com 10 ml de MC-30, uma vez em 200 g por 10 minutos. O sedimento é ressuspenso no volume desejado com MC-30. Nesse ponto, na execução da técnica de FIV, realiza-se um "swim-up" no último sedimento com adição de 0.5 ml de MC-30, e incubação por 15 minutos em atmosfera de CO2 a 5% na temperatura de 37º C. Em seguida, acerta-se a concentração de espermatozóides para a inseminação dos oócitos. Por outro lado, uma solução de Nycodenz também pode ser utilizada para preparar gradientes, selecionar e recuperar espermatozóides móveis (Gellert-Mortimer e cols., 1988). Mauri e cols. (1993) analisaram um total de 17 ciclos de FIV com o objetivo de comparar os índices de clivagem embrionária após a inseminação de oócitos com espermatozóides capacitados pela técnica modificada de sedimentação-migração (grupo A) e pelos gradientes de densidade do Nycodenz (grupo B). Todas as amostras de sêmen eram normais quanto a concentração e motilidade dos espermatozóides. Os resultados não mostraram diferença entre os índices de clivagem nos embriões do grupo A versus os do grupo B. Assim sendo, não houve vantagem no emprego dos gradientes de densidade de Nycodenz na capacitação dos espermatozóides em relação `a técnica clássica modificada de sedimentação-migração.
Referências Bibliográficas
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)