COVID-19 REDLARA: LIvros (Reprodução Assistida)
Criopreservação de embriões e gametas
Princípios básicos da criopreservação
Os primeiros estudos de Whittingham e cols. (1972) mostraram que o congelamento lento de embriões de camundongo nas fases iniciais de clivagem, na presença de dimetil-sulfóxido (DMSO), seguido de um processo lento de descongelamento, não afetava a sobrevida dos embriões e seu futuro desenvolvimento. Em 1983, Trounson e Mohr obtiveram uma gestação clínica após criopreservarem pela primeira vez embriões humanos usando uma variação deste método. Em seguida, diversos grupos relataram a eficácia desta metodologia (Zeilmaker e cols., 1984; Mohr e cols., 1985; Trounson, 1986). Habitualmente, quando um líquido está sendo congelado, a temperatura poderá cair abaixo de 0º C, neste momento o gelo é formado e a temperatura retorna a 0º C, até que o líquido seja totalmente congelado. Nesse processo em que a temperatura do líquido pode ser reduzida abaixo do ponto de congelamento sem a solidificação do líquido, ocorre uma liberação do calor de fusão necessário para formar a estrutura molecular da água sólida. O sucesso da criopreservação da célula depende da velocidade do congelamento e da composição da solução, onde as células são congeladas. Inicialmente, a água extracelular congela, no momento em que a célula se aproxima do ponto de congelamento, removendo o líquido extracelular, fato que acarreta um aumento de osmolaridade. Com esse desiquilíbrio osmótico, a água é retirada da célula para o compartimento extracelular, ocasionando uma diminuição do volume celular. Uma adequada desidratação celular depende da velocidade do congelamento de forma a não provocar uma lise da célula. No caso de um congelamento muito lento, o equilíbrio permanecerá constante e a célula ficará exposta ao crioprotetor e ao estresse osmótico por tempo prolongado, fato que poderá acarretar a morte celular. Ao contrário, no caso de congelamento muito rápido, a desidratação será insuficiente e causará a formação de gelo intracelular ocasionando a lise da célula na ocasião do descongelamento (Lopez-Bejar e cols., 1994). Para evitar o dano celular, mesmo com uma velocidade de descongelamento controlada, há necessidade do emprego de crioprotetores (Figura 9.1).
Crioprotetores
Em geral, os protocolos para criopreservação de embriões humanos acompanharam os desenvolvidos para congelamento de embriões de camundongo, entretanto, algumas modificações foram introduzidas, como novos crioprotetores e a adição de sucrose para a desidratação dos embriões antes do congelamento e para o auxílio na remoção dos crioprotetores (Lassalle e cols., 1985; Cohen e cols., 1986). O emprego dos crioprotetores tem como objetivo melhorar a taxa de sobrevida das células durante o processo de congelamento e descongelamento. Podem ser divididos em dois grupos : extracelulares (sacarose, polivinilpirrolidina = PVP, dextran), e intracelulares (glicerol, DMSO, propanodiol = PROH). A ação crioprotetora é de difícil explicação, entretanto, admite-se que uma das principais seria diminuir o ponto de congelamento da solução. Por exemplo, com o DMSO, a formação de gelo intracelular ocorrerá somente nas baixas temperaturas entre -40º C e -50º C. A permeabilidade da membrana varia entre os diferentes estágios do desenvolvimento celular ou embrionário, tal fato acarreta a utilização de um crioprotetor para cada situação específica. Dessa forma, emprega-se no congelamento de oócitos DMSO e PROH, de zigotos ou embriões, de 2 a 4 células o PROH e em embriões de 8 a 16 células o DMSO, em caso de blastocistos, o glicerol e DMSO. Freqüentemente, os crioprotetores são tóxicos para as células (o propanodiol é o menos tóxico dos crioprotetores). Alguns autores relataram uma atividade partenogênica com o uso de propanediol (Van der Elst e cols., 1988). Van der Elst e cols. (1995) em estudo prospectivo e randomizado mostraram, num programa de fertilização "in vitro" (FIV), que o DMSO é superior ao PROH na criopreservação de embriões humanos excedentes. O índice de sobrevida embrionário foi para o protocolo com DMSO de 52.6% versus 32% para aquele com PROH. A taxa de gestação clínica para as transferências com uso de DMSO foi 17.2%, significativamente maior do que a de 3.9% obtida com PROH. Finalmente, devem ser analisados antes da definição do agente de criopreservação : 1. O tipo de célula que será criopreservada. 2. A concentração do crioprotetor. 3. A toxicidade específica 4. O tempo de equilíbrio.
Procedimentos de congelamento e descongelamento
Geralmente, três procedimentos de criopreservação celular podem ser usados : lento, rápido e ultra-rápido. No lento, a velocidade de congelamento é de 0.3º C por minuto do "seeding" até aproximadamente -80º C, antes de mergulhar o material em nitrogênio líquido. A duração do congelamento variará de 3.5 a 4 horas. O descongelamento é feito na velocidade de 10º C por minuto. No rápido, a velocidade de congelamento é de 0.3º C do "seeding" até -30º C. A duração do congelamento situa-se entre 2 a 2.5 horas. O descongelamento é feito na velocidade de 30º C por minuto. O equipamento usado nestes procedimentos é um "freezing" programável. No ultra-rápido e na vitrificação, a velocidade de congelamento será de 2500º C por minuto. A duração do congelamento ficará entre 2 a 3 minutos, e a velocidade de descongelamento > 300º C por minuto. A vitrificação é a solidificação do líquido sem ocorrer a formação de gelo (cristalização), devido ao aparecimento de uma viscosidade elevada durante a fase de congelamento. Assim sendo, no congelamento de soluções contendo altas concentrações de crioprotetor, esta torna-se viscosa durante sua passagem do estado líquido para o estado sólido não estruturado. Para a obtenção da vitrificação, as soluções de crioproteção devem ser aumentadas em 40% na relação peso/volume. Em 1988, Trounson e Sjöblom descreveram a obtenção de gestações após a transferência de embriões humanos criopreservados em altas concentrações de DMSO (3.5M) e sucrose (0.25M), por 2 a 3 minutos, com subseqüente conservação em nitrogênio líquido. O descongelamento foi rápido na temperatura de 37º C. A principal vantagem nessa metodologia seria não requerer o uso da aparelhagem de congelamento, além da velocidade na sua execução. O método ultra-rápido é um método simples e barato para a criopreservação de embriões humanos. Barg e cols. (1990) relatam uma taxa de gestação clínica por transferência de 10.5% para embriões criopreservados pelo método ultra-rápido. A atividade biológica celular pode ser conservada indefinidamente em nitrogênio líquido. Apesar de possíveis reações fotofísicas previsíveis em temperatura de -196º C, contudo, experimentos executados em camundongos negam a presença de danos genéticos.
Variáveis que afetam os resultados clínicos do processo de criopreservação embriões
Em geral, os fatores que influenciam a eficácia da transferência de embriões a fresco (idade da paciente, qualidade e número de embriões), também afetariam as taxas de gestações obtidas com embriões descongelados. Acredita-se que o congelamento de embriões morfologicamente classificados como de melhor qualidade poderia acarretar uma possibilidade de maior sucesso após o processo de descongelamento e transferência embrionária. A distribuição equitativa entre embriões de mesma qualidade para transferência a fresco, ou para o processo de congelamento, teria influência significativa nas taxas de gravidez de um programa de criopreservação de embriões. A proporção de ciclos de FIV que necessitam de criocongelamento varia em função do grau de estimulação ovariana e da política de transferência embrionária. O sucesso na transferência de embriões criopreservados aumentaria a eficácia final de um único ciclo de estimulação ovariana. Atualmente, dois esquemas hormonais são usados para a transferência de embriões descongelados : 1. Ciclo natural. 2. Ciclo artificial com bloqueio ovariano com análogos de GnRH (GnRH-a) + associação hormonal com estrógeno e progesterona. Tucker e cols. (1995) acreditam que não há diferença nas taxas de gravidez quando os embriões descongelados são transferidos em ciclos naturais ou naqueles com reposição hormonal pós-bloqueio ovariano com GnRH-a. Queenan e cols. (1994) realizaram 628 transferência de embriões descongelados, resultando uma taxa de gestação em ciclo natural de 18% versus em ciclo artificial de 22%. Irianni e cols. (1992) referem taxas de gravidez por transferência de embriões descongelados de 22%. Heijnsbroek e cols. (1995) publicaram uma taxa de parto por transferência embrionária de 10%, fato que elevou sua taxa de bebê em casa por procedimento (fresco + descongelado) em 6%. Lin e cols. (1995) demonstraram que o sucesso da transferência de embriões descongelados é significativamente maior na população cujas pacientes engravidaram na transferência a fresco, do que naquelas que não obtiveram gestação previamente. Wada e cols (1994) observaram uma incidência de malformações maiores em 1% dos recém-nascidos cujas gestações foram conseguidas pela transferência de embriões criopreservados, tal valor é inferior aos relatados para os programas de FIV com transferência de embriões a fresco. A Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (1995) refere que no ano de 1993 nos Estados Unidos, um total de 234 programas realizaram transferência de embriões criopreservados. Assim sendo, um total de 6194 transferência de embriões resultaram em 984 gestações, ou seja, 15.9% de gestações por transferência, obtendo-se um índice final de parto de 11.9% por transferência de embriões descongelados. Além disso, Van Voorhis e cols. (1995) relataram um acréscimo sobre as taxas de gestação por punção a fresco de 6.6%. Frederick e cols. (1995) estudaram 36 pacientes que criopreservaram todos os embriões obtidos no ciclo a fresco, em virtude do alto risco para o desenvolvimento de síndrome de hiperestimulação ovariana ou que possuiam endométrio inferior a 8 mm de espessura. A criopreservação foi realizada com PROH 1.5M, no estágio de pronúcleo ou embrião de duas células. A transferência embrionária pós-descongelamento foi executada em ciclos com reposição hormonal em 70% dos casos e em ciclo natural em 30%. Obteve-se uma taxa de gravidez por ciclo de transferência de 33% e um índice de parto por transferência de 28.6%. A taxa de implantação foi de 9.1%. Kaufmann e cols. (1995) observaram que a criopreservação de blastocistos após cultivo em sistema de co-cultura poderia produzir índices de gravidez por transferência de embriões descongelados de 21.7% e de gestações clínicas de 19%. O sucesso da criopreservação de embriões submetidos a ICSI ainda é motivo de dúvidas. Van Steirteghem e cols. (1994), criopreservando embriões excedentes provenientes de ciclos após ICSI, verificaram que 53% dos embriões descongelados sobreviveram, obtendo-se uma taxa de gestação clínica por transferência de 12.9% e um índice de partos por transferência de 5.9%. Ao contrário do programa FIV do mesmo serviço com a mesma técnica de criopreservação, conseguiram uma taxa de sobrevivência de 51%, com um índice de gestação clínica por transferência de 10.7% e um índice de parto por transferência de 7.1%. A incidência de aborto pré-clínico para as pacientes de ICSI foi de 40.9% e para as de FIV de 27%. Uma explicação para a alta incidência de aborto pré-clínico em gestações obtidas através de embriões criopreservados após ICSI ainda não ficou clara. Al-Hasani e cols. (1996) compararam a performance de lotes embrionários obtidos após FIV convencional ou ICSI ambos congelados na fase de pronúcleo. Os dados não evidenciaram diferenças significativas nas taxas de gravidez após transferência embrionária entre o grupo de FIV (17%), e o de ICSI (20%). Entretanto, a criopreservação de embriões poderá acarretar inúmeros problemas de natureza ética, especialmente os ligados com situações de morte, doença incapacitante de um dos integrantes do casal, divórcio ou possíveis desacordos quanto ao destino que possa ser dado aos embriões não utilizados com o decorrer do tempo.
Método de congelamento ultra-rápido para criopreservação de embriões
No Brasil, não há publicações relatando gestações após criopreservação de embriões por qualquer metodologia. Franco Jr. e cols. (1994) relataram pela primeira vez a obtenção de uma gestação clínica após criopreservação e descongelamento de embriões pelo método ultra-rápido.
O método ultra-rápido descrito por Trounson e cols. (1987) consta das seguintes soluções :
1. Preparo das soluções (Figura 9.2) :
2. Solução A
Menezo B2, IVF-50..................... 4.0 ml
Soro inativado da paciente........... 1.0 ml
3. Solução B
Solução A ................................ 3.935 ml
DMSO (14.079 M) ...................... 1.065 ml
4. Solução de congelamento :
Pesar 0.428 g de sucrose e colocar num tubo graduado de 15 ml (Corning), completar para 5.0 ml com a solução B (solução final possui 3.0 M de DMSO e 0.25 M de sucrose). Filtrar a solução final em membrana de 0.22 m e depositar em tubo estéril (Corning). Gasificar com uma mistura de N2 a 90%, CO2 a 5% e O2 a 5%. Manter a solução de congelamento na temperatura de 4º C, pelo período mínimo de 24 horas e no máximo de 72 horas.
5. Soluções de descongelamento :
Pesar 0.428 g de sucrose, colocar em tubo de graduado de 15 ml (Corning), completar para 5.0 ml com a solução A (a solução final possui 0.25 M de sucrose). Filtrar a solução com membrana de 0.22 m e gasificar com uma mistura de N2 a 90%, CO2 a 5% e O2 a 5%. Essa solução mãe deve ser preparada no dia do descongelamento e mantida na temperatura ambiente. Em seguida, preparar 3 soluções de descongelamento : Solução I (solução mãe 2 ml + solução A 1ml); Solução II (solução mãe 1 ml + solução A 1ml); Solução III (solução mãe 1ml + solução A 2 ml).
Técnica de congelamento
Retirar os embriões da solução A e colocá-los em placa de Falcon contendo solução de congelamento. Transferir os embriões para as "paillettes" (previamente identificadas com o nome da paciente e data do congelamento) preenchendo-as conforme a sequência : meio, ar, meio + embriões, ar, meio (Figura 9.3). Selar a "paillette" na extremidade do algodão utilizando a própria solução de congelamento e pó selante. Os embriões devem ficar expostos na solução de congelamento por 2.5 minutos na temperatura ambiente, tempo necessário para o equilíbrio com o crioprotetor, (incluindo o tempo de preenchimento da "paillettes"). Finalmente, as "paillettes" acomodadas em raqui são mergulhadas em recipiente contendo nitrogênio líquido.
Técnica de descongelamento
Retirar a "paillette" do nitrogênio líquido e mergulhar em banho-maria `a temperatura de 37º C por 6 segundos. Enxugar a "paillette" e cortar uma das extremidades. Expulsar da "paillette" a solução de congelamento mais os embriões com o auxílio de uma seringa de 1.0 ml, colocando-os na temperatura ambiente por 10 minutos em cada uma das soluções de descongelamento I, II e III (Figura 9.4). Em seguida, transferir os embriões para a solução A, pré-aquecida (37º C) e incubar em atmosfera de CO2 a 5% e temperatura de 37º C por tempo mínimo de 3 hora, após o que será realizada a transferência embrionária.
Criopreservação de oócitos
A criopreservação de oócitos humanos ainda é uma metodologia em desenvolvimento, apesar de algumas gestações pós-descongelamento terem sido descritas em meados da década de oitenta (Chen, 1986; Al-Hasani e cols., 1987; Van Uem e cols., 1987). Acredita-se que o fuso tubular do oócito maduro é sensível para as mudanças de temperatura e não disjunções de cromátides podem ocorrer durante o processo de congelamento, resultando em aneuploidias após a fertilização (Van der Elst e cols., 1988; Pickering e cols., 1990). Alguns também referem um aumento da liberação de grânulos corticais que levariam a um endurecimento da zona pelúcida (Trounson e Kirby, 1989). Até o momento, não é satisfatória a taxa de sobrevida dos oócitos humanos descongelados, os índices de sucesso variam de 27% a 64% (Todorow e cols., 1989; Imoedemhe e Sigue, 1992; Gook e cols., 1993). Gook e cols. (1994) verificaram uma taxa de sobrevida dos oócitos de 51% logo após o descongelamento, entretanto, houve uma queda para 41% quando nova observação foi realizada após 3-4 horas. Em geral, os índices de fertilização dos oócitos descongelados são inferiores aos obtidos com a inseminação a fresco e uma incidência alta de fertilização anormal tem sido descrita (Al-Hasani e cols., 1987). Kazem e cols. (1995) referem uma taxa de fertilização de oócitos descongelados de 45.9% quando submetidos a ICSI versus 13.5% por FIV convencional. Gook e cols. (1995) referem resultados idênticos quanto a presença de fertilização normal entre oócitos criopreservados após inseminação (34% = 26 oócitos descongelados/9 fertilizações normais) versus aqueles onde a ICSI foi empregada (35% = 20 oócitos / 7 fertilizações normais). Kazem e cols. (1992) afirmaram que os índices de fertilização de oócitos humanos maduros pré-ovulatórios congelados através de método lento (-3º C por minuto) ou congelamento rápido (-1000º C por minuto) quando descongelados a 0º C não mostraram problemas na fertilização quando comparados com o grupo controle. Tal fato, sugere que o choque do congelamento não é um importante fator no processo de criopreservação. Imoedemhe e Sigue (1992) usando como crioprotetores PROH e sucrose e um método de congelamento lento, observaram que os oócitos criopreservados com "cumulus" possuiam maior sobrevidade (54%) do que aqueles sem essa camada celular (27%), sendo os níveis de fertilização de 44% versus 25%, respectivamente para com e sem cumulus.
Criopreservação do sêmen
Congelamento vertical
O congelamento do sêmen é uma técnica antiga sendo um dos maiores avanços nessa área a descoberta das propriedades crioprotetoras do glicerol. Ao passar dos anos, várias modificações foram descritas com a finalidade de aumentar a taxa de recuperação do esperma criopreservado. Em 1963, introduziu-se o nitrogênio líquido para o processo de estocagem. Atualmente, tornou-se obrigatório o emprego de sêmen congelado (uso após 6 meses de congelamento desde que o doador apresente novo teste negativo para SIDA) nos programas de inseminação com esperma de doador, pela possibilidade da existência no esperma do vírus da síndrome de imunodeficência adquirida (SIDA). O congelamento do sêmen necessita do preparo de 3 soluções crioprotetoras com variações na concentração dos seus componentes químicos (Lucena, 1990). As principais substâncias que participam na sua constituição são as seguintes : gema do ovo 50% e nutrientes.
Preparo da solução de gema de ovo
A gema do ovo possui efeito protetor sobre a motilidade dos espermatozóides. No preparo da solução de gema de ovo usam-se 6 ovos frescos, dos quais separa-se a gema da clara. Em seguida, coloca-se a gema sobre o papel de filtro para reter a membrana perivitelínica que é tóxica, para isto pressiona-se a gema entre o papel de filtro para extrair seu conteúdo e deposita-se o recuperado numa proveta estéril de 100 ml. O volume ocupado pelas gemas é anotado e adiciona-se uma quantidade igual de água destilada a fim de se obter uma solução a 50%. A proveta é fechada com papel alumínio e homogeinizada delicadamente. A solução final é repartida em vários tubos cônicos graduados e estéreis que são centrifugados em 3500 rotações por minuto durante 30 minutos, após o que retira-se o sobrenadante e repete-se a centrifugação por 15 minutos (para conservar as lipoproteínas de baixo peso molecular cuja ação protetora é estabilizar a membrana do espermatozóide). Os sobrenadantes obtidos em todos os tubos são colocados em Erlenmeyer estéril de 150 ml. A solução de gema de ovo (50%) pode ser conservada durante 24 horas na temperatura de 4º C, antes de terminar a preparação do meio crioprotetor.
Preparo dos nutrientes
Os nutrientes usados (citrato de sódio, frutose, bicarbonato de sódio) são pesados em balança de precisão. Dissolver os componentes nas concentrações indicadas (Tabela 9.1) em água destilada 3 ml e adicionar a esta mistura glicerol (previamente medido em proveta de 100 ml). Adiciona-se a quantidade necessária de gema de ovo (depende da concentração de espermatozóides na amostra) e complementa-se para 100 ml com água destilada.
Pasteurização do crioprotetor
Para a pasteurização do crioprotetor, aquecer um volume de água em vasilha. Introduzir um termômetro limpo e desinfetado com álcool dentro do Erlenmeyer que contém a solução crioprotetora, transferir esta para a vasilha com água aquecida, agitar suavemente e quando a temperatura atingir 68º C retirar o meio, pois valores superiores podem endurecer a gema. A conservação do meio crioprotetor é realizada após a solução crioprotetora esfriar, adiciona-se penicilina G sódica (50 mg/l). Divide-se o material em tubos de 10 ml para seu armazenamento no "freezer" a 18º C. O período máximo de congelamento será de 3 meses, sendo permitido descongelar e recongelar sem nenhum problema.
Análise da qualidade da solução crioprotetora
Para o controle de qualidade da solução crioprotetora coloca-se 50 ul desta em contacto com 100ul de sêmen liquefeito e analisa-se uma gota deste preparado no microscópio, deve-se obter uma motilidade de no mínimo 70%, em relação ao controle inicial. Em princípio, não devem ser observados espermatozóides com flagelos enrolados (muito sal) ou flagelos rígicos (pouco sal).
Cuidados especiais e resultados clínicos
Em seguida, a amostra de sêmen liquefeita na temperatura de 37º C é misturada com a solução crioprotetora adequada para a concentração inicial obtida : Solução I : > 200 milhões de espermatozóides por ml, proporção: 1 volume de sêmen para 1 volume de solução crioprotetora. Solução II : 100 a 200 milhões de espermatozóides por ml, proporção: 2 volumes de sêmen para 1 volume de solução crioprotetora. Solução III : de 20 a 100 milhões de espermatozóides por ml, proporção 3 volumes de sêmen para 1 volume da solução crioprotetora. Rotineiramente, as "paillettes" de 0.5 ml são identificadas com o nome do paciente e a data do congelamento. O sêmen mais a solução crioprotetora são aspirados com uma seringa de 1 ml até tocar no tampão de algodão da "paillete". Imediatamente, selar a extremidade oposta com pó selante (deixar um espaço de 0.5 cm a 1.0 cm antes do ponto do selante). Para o congelamento do sêmen, as "paillettes" preenchidas são colocadas verticalmente num suporte com capacidade para 42 "paillettes". A fim de que o congelamento seja idêntico nas diferentes "paillettes", o suporte deve estar totalmente preenchido, quando isto não for possível, completar o suporte com "paillettes" maciças de tamanho e massa igual as preenchidas com sêmen. O suporte com as "paillettes" é colocado dentro de um recipiente metálico menor (nº 1) que por sua vez é adaptado dentro de outro recipiente metálico de maior tamanho (nº 2), estes materiais são colocados dentro de uma caixa de isopor (Figura 9.5). O nível de nitrogênio líquido dentro dos recipientes metálicos (intercomunicados por orifícios) deve entrar em contacto com a base do suporte acrílico das "paillettes", no entanto, o nitrogênio líquido não deve tocar as "paillettes". A velocidade do congelamento é idêntica em todas as "paillettes" sendo neste momento de cerca de 200º C por minuto. A cristalização ocorre de maneira espontânea depois da temperatura de -18º C. Esta cristalização demora de 10 a 15 segundos, logo a velocidade de congelamento (praticamente linear) vai de 170º C por minuto até -80º C. Nesta temperatura a curva de esfriamento toma uma forma assintótica até -150º C, e a duração total do esfriamento é de aproximadamente 2 minutos. Em seguida, as "paillettes são submersas em nitrogênio líquido previamente colocado em isopor e transferidas para aqui identificada, armazenadas em canecas no botijão com nitrogênio líquido. O descongelamento do sêmen é realizado na temperatura ambiente em aproximadamente 2 minutos. Deve-se lembrar que as bactérias aeróbicas consideradas comensais estão presentes na maior parte dos ejaculados a fresco e recuperam-se depois da criopreservação em nitrogênio líquido. Finalmente, realiza-se o controle do processo de congelamento-descongelamento, examinando-se a motilidade e a vitalidade dos espermatozóides. Em 1994, Baruffi e cols. descreveram os resultados do programa de criopreservação do Centro de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá Junqueira. A taxa média de sobrevida dos espermatozóides após o descongelamento foi de 77.4 ± 11%. O número médio de espermatozóides móveis inseminados variou de 1.35 milhões a 18.45 milhões por aplicação. A taxa de gravidez por ciclo foi de 27.7%. A técnica de criopreservação utilizada mostrou-se eficaz, de manuseio simples e de custo operacional baixo.
Composição de três soluções para criopreservação de sêmen
Tabela 9.1 - Composição de três soluções para criopreservação de sêmen
Soluções I II III
Sêmen/meio 1/1 2/1 3/1
Gema de ovo 50% 36 ml 54 ml 62 ml
Citrato de sódio 0.66 g 1.00 g 1.32 g
Frutose 1% 2.0 g 3.0 g 4.0 g
Glicerol 7% 14 ml 21 ml 28 ml
Bicarbonato sódio 0.10 g 0.15 g 0.20 g
Penicilina 0.06 g 0.06 g 0.06 g
Água destilada q.s.p. 100 ml para todos os tubos
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)