COVID-19 REDLARA: LIvros (Reproducción Humana e Infertilidad)
Criopreservación de Gametos y Embriones Humanos
Pablo Valencia Llerena INTRODUCCIÓN MÉTODOS DE CONGELAMIENTO DE SEMEN EFECTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN EN LA MOVILIDAD Y FERTILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES CRIOPRESERVACIÓN DE OVOCITOS MATERIALES UTILIZADOS PARA CONGELAMIENTO DE EMBRIONES Equipo básico PROTOCOLOS DE CONGELAMIENTO Y DESCONGELAMIENTO DE EMBRIONES MANEJO CLÍNICO DE LOS CICLOS EN EL PROGRAMA DE CONGELAMIENTO DE EMBRIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
La historia científica de la criopreservación de semen se remonta a 1677, cuando una
carta escrita por Antonie van Leeuwenhoek(1) a la Real Sociedad de Londres reporta su
hallazgo de haber encontrado células móviles en el semen humano. Casi 100 años
después, el cura italiano Abbe Lázaro Spallanzani(2) en 1776, reportó sus observaciones
que los espermatozoides humanos, de potros y de ranas podrían ser congelados en la
nieve por 30 minutos y luego recalentados con recuperación de su movilidad. Luego en
1866 otro italiano, Mantegazza(3), reportó sus hallazgos de que el semen puede ser
preservado al reducirse la temperatura. Además, él escribió: “Si el semen humano puede
ser preservado por más de 4 días a la temperatura que se derrite el hielo sin pasar por
ningún cambio, de seguro que los investigadores del futuro podrán mejorar la calidad de
los caballos y vacas, sin tener que pagar mucho dinero por el transporte de los
sementales. Será fácil llevar a cabo inseminaciones artificiales con semen congelado
enviado de una localidad o otra. También es posible que el marido que muere en la
guerra pueda fertilizar a su mujer y tener descendencia, inclusive después de su muerte”.
Hoy en día, las predicciones de Mantegazza se han cumplido y su visión fue mucho más
excepcional si tomamos en cuenta la falta de evidencia científica de su época.
El desarrollo de la criopreservación es paralela al de la inseminación artificial en
animales, y fue el éxito comercial de ésta la que ayudó a que el estudio de la
criopreservación seminal humana progresara.
Fueron Chang y Walton, en 1940(4), los que sugirieron que el enfriamiento de los
espermatozoides puede prolongar su vida al reducir su actividad metabólica. Una de las
primeras sustancias criopreservadoras fue la yema de huevo, introducida por Phillips en
1939, la cual evita el shock frío de los espermatozoides sometidos al congelamiento. En
1940 se hicieron varios intentos para congelar el semen solamente bajando su
temperatura, pero dieron como resultado una recuperación muy baja como consecuencia
de la formación de cristales de hielo en el interior de los espermatozoides. En esa época
no se daba importancia a la acción de las sustancias crioprotectoras, y los primeros
intentos para evitar la formación de cristales de hielo fue el uso de la vitrificación, un
proceso de congelamiento tan rápido que no permite que se formen los cristales. Lo que
realmente cambió las técnicas de congelamiento de semen fue el descubrimiento del
glicerol, que provee las condiciones adecuadas para que el espermatozoide sobreviva a
temperaturas bajo cero.(5) A partir de entonces se desarrollaron varios experimentos para
mejorar las técnicas de congelamiento, hasta que en 1954 nació el primer niño producto
de un descongelamiento de semen realizado por Bunge.(6)
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Mecanismo de acción de los crioprotectores
Las crioprotectores se clasifican en permeables y no permeables, según penetran ó no a la
célula. En ausencia de agentes crioprotectores, muy pocos espermatozoides de cualquier
especie sobreviven al congelamiento a temperaturas bajo cero. La adición de
crioprotectores al semen humano expande la tolerancia de los espermatozoides al ser
congelados a una velocidad menor, y la velocidad ideal de enfriamiento depende del tipo
y concentración del crioprotector utilizado. El más ampliamente utilizado para los
espermatozoides es el glicerol; agente permeable que ejerce su acción protectora al
reducir la concentración de electrolitos a la que la célula está expuesta durante su
enfriamiento lento y su final congelamiento. La velocidad de enfriamiento de los
espermatozoides humanos generalmente es de –10°C por minuto, esto permite la
cristalización extracelular y la subsecuente deshidratación de la célula, haciendo que la
caída de la temperatura rápida a –196°C, que es la temperatura del nitrógeno líquido, no
sea deletérea. Se ha observado una alta tasa de sobrevida cuando se utilizan agentes no
permeables como la sucrosa, la cual se agrega al medio crioprotector. La sucrosa como
otros disacáridos, no penetran las membranas celulares pero su presencia en el medio
extracelular ejerce una protección osmótica que regula el paso de agua dentro y fuera de
la célula. En 1983, Mahadevan y Trounson reportaron que la combinación de 50mM de
sucrosa y 7.5% de glicerol provee una recuperación de la movilidad es muy superior a la
de glicerol al 7% solo.(7)
Daño celular después del descongelamiento del semen
Actualmente ha quedado bien establecido que para lograr una buena sobrevida celular el
método de congelamiento debe ser combinado con un excelente procedimiento de
descongelamiento. La velocidad del enfriamiento afecta tanto el movimiento del agua
extracelular como a la extensión de la formación de hielo intracelular. Esta velocidad de
enfriamiento debe permitir la formación de hielo extracelular a una velocidad que
también permita el movimiento hacia afuera del agua intracelular por un mecanismo de
osmosis, sin que se produzca la cristalización del agua intracelular antes de que la célula
se encuentre completamente deshidratada. Por lo tanto, cuando el espermatozoide llega a
-196°C, el ambiente tanto intracelular como extracelular de la célula es muy diferente.
Puede ocurrir todavía daño a la célula si la velocidad de descongelamiento no es
compatible con la velocidad de congelamiento.
Equipo y materiales usados en congelamiento de semen
El proceso de congelamiento del semen comprende 4 etapas:
1) Procedimientos preparatorios: recolección del semen, preparación del
crioprotector, y dilución del semen.
2) Colocación de la mezcla de semen con el crioprotector en pajillas o viales.
3) Proceso de congelamiento.
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4) Almacenamiento del material criopreservado.
Cada etapa requiere de materiales diferentes, tratando de que éstos sean los mejores
disponibles en el mercado.
Recolección del semen y mezcla con el crioprotector
Para ésta etapa se recomienda seguir las instrucciones establecidas por la Organización
Mundial de la Salud (OMS), las mismas que se entregarán al paciente en una hoja de
instrucciones escritas con claridad a fin de recoger el semen y trasladarlo al laboratorio.
Lo ideal es que la muestra se recoja en la intimidad de una dependencia próxima al
laboratorio. De lo contrario, debe ser enviada al laboratorio antes de transcurrida una
hora de su recolección, y si la motilidad de los espermatozoides es anormalmente baja
(menos de 25% con progresión rápida), se debe valorar la toma de otra muestra. La
muestra debe ser obtenida por masturbación y eyacularse dentro de un recipiente limpio
de vidrio preferentemente o plástico de boca ancha; si se usa plástico, se debe asegurar
que éste no contenga sustancias tóxicas para el espermatozoide. El recipiente debe estar
tibio para reducir al mínimo el riesgo de shock por frío. Es importante que el paciente
orine y se lave las manos y el pene antes de recoger la muestra. Por lo general, no se
deben usar preservativos para recoger el semen y no comprometer la viabilidad de los
espermatozoides.
Cuando por circunstancias especiales no fuera posible obtener el semen mediante
masturbación, existen preservativos inertes especiales para tal fin. El coitus interruptus no
es aceptable para la recolección del semen, porque puede perderse la primera porción del
eyaculado, que suele contener la mayor concentración de espermatozoides móviles.
Además, puede haber contaminación celular y bacteriana de la muestra y el pH ácido del
líquido vaginal ejercerá una influencia adversa sobre la movilidad de los
espermatozoides. La muestra debe protegerse de las temperaturas extremas durante su
traslado al laboratorio.
Luego de la recolección de la muestra se procederá a dejar la misma a 37°C durante unos
30 minutos, con objeto de que se complete la licuefacción. Una vez licuada la muestra se
toma 10 ul de la misma y se procede a realizar un conteo del número de espermatozoides
y su movilidad. Luego se saca el medio crioprotector y se deja a temperatura ambiente.
Al inicio, en 1984, en el Centro Médico de Fertilidad y Esterilidad (CEMEFES) se
preparaba en el laboratorio el crioprotector, pero debido a que se trataba de un
procedimiento largo y tedioso y dado que en la actualidad existen varios medios listos
para usar, cuya eficacia es muy alta, actualmente se utiliza FREEZING MÉDIUM Test
Yolk Buffer (Irvine Scientific, California USA) para todos los procesos de congelación
de semen. Una vez que el crioprotector se encuentra listo para su utilización, se procede a
colocarlo en el semen, gota a gota, hasta finalmente lograr una mezcla 1:1. A
continuación se deja la mezcla a temperatura ambiente por aproximadamente 10 a 15
minutos, a fin de permitir que el crioprotector penetre al interior de las células.
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Colocación de la mezcla en pajillas o viales
El semen puede ser congelado en viales o en pajillas. Estas unidades deben ser
correctamente identificadas poniendo el nombre del paciente, fecha de congelamiento,
número del congelamiento y cantidad de pajillas congeladas. Los viales generalmente
tienen una capacidad para 1.5ml y están disponibles en varios colores y marcas. Las
pajillas para congelamiento de semen son de 0.5 ml y de 13 cm de largo. Uno de sus
extremos está sellado de fábrica con un algodón y el otro extremo se sella en el
laboratorio con alcohol polivinilo, el cual se solidifica al estar en contacto con líquido.
Para llenar la pajilla se conecta el extremo con algodón a una jeringa de insulina con un
adaptador de silicona. Una vez conectada, se aspira un total de 0.5 ml de la mezcla de
semen más crioprotector, se sella el otro extremo de la pajilla y se la coloca en un
dispositivo donde se la llevará al recipiente de nitrógeno líquido en el que se realizará el
proceso de congelamiento.
Congelamiento en vapor de nitrógeno líquido
Cuando se quiera realizar el congelamiento de espermatozoides en una cámara cerrada en
fase de vapores de nitrógeno líquido, únicamente se deberá adquirir los tanques de
nitrógeno para almacenamiento. En este método se suspende la mezcla de semen con
crioprotector de forma vertical en la fase de vapores de nitrógeno líquido y es el método
más fácil de congelamiento. Las pajillas ó los viales son suspendidos en una cámara
cerrada en vapores de nitrógeno líquido especialmente diseñada para el objeto. Se
colocan las pajillas durante 30 minutos en ésta fase, donde teóricamente se obtiene una
velocidad de congelamiento de -10°C/min y se llega a una temperatura de -80°C. Luego,
las pajillas con colocadas directamente en nitrógeno líquido, cuya temperatura en estado
natural es de -196°C y de ahí son almacenadas en los tanques.
Máquina de congelamiento
Existen varios tipos y marcas de equipos para congelamiento. La Kyro 10 (Planer
Products Ltd, Sunbury, UK) es un equipo compacto que opera desde los 30°C hasta los -
180°C y permite controlar la velocidad de congelamiento, tanto vertical como
horizontalmente. En el CEMEFES, como en muchas otras clínicas a nivel mundial, se
cuenta también con el Freeze Control CL183 (Cryologic Pty, Mt Waverly, Australia) que
es una máquina que controla la velocidad de congelamiento desde los 40oC hasta los
–80°C. Este equipo opera con un litro de nitrógeno líquido por hora. Debido a su fácil
uso y versatilidad, es ideal para cualquier programa de reproducción asistida, ya que
también es una excelente opción para congelamiento de embriones con protocolos lentos.
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El programa de congelamiento para espermatozoides empieza con una velocidad de
congelamiento de -1°C/min desde temperatura ambiente hasta los 5°C, seguido de -
10°C/min hasta los –85°C. Una vez que se haya logrado esta temperatura, las pajillas
pueden pasarse directamente al nitrógeno líquido para su posterior almacenamiento a
-196°C.
El criterio general usado para establecer la viabilidad de los espermatozoides congelados
y posteriormente descongelados, es la preservación de su movilidad, pero ésta no se
relaciona con su capacidad de fertilización. La única prueba para valorar el éxito de una
técnica de congelamiento, es que los espermatozoides descongelados fertilicen un óvulo
y produzcan un embarazo que llegue a término. Como en nuestro laboratorio se cuenta
con el crioprotector adecuado y un protocolo de congelamiento bien establecido, el
siguiente paso es determinar qué efecto tienen estas técnicas en la capacidad de
fertilización del espermatozoide.
Los niveles de ATP, el porcentaje de espermatozoides que sobreviven a una prueba hipoosmótica,
el tiempo de sobrevida in vitro, la habilidad de penetrar el moco cervical y la
movilidad de los espermatozoides descongelados, son menores si se los compara con
semen fresco.(8) También se ha demostrado que no existe una diferencia significativa
entre el porcentaje de penetración a la zona libre del óvulo de hámster que se logra con
semen descongelado y con semen fresco, pero sí que el índice de penetración va
disminuyendo con el paso del tiempo, indicando que la fertilidad en sí no se ve afectada
en espermatozoides humanos como resultado del proceso de congelamiento, pero que
ésta puede afectarse si el tiempo de almacenamiento es demasiado largo.
Se ha establecido que la velocidad de congelamiento óptima para el semen de mamíferos
se encuentra entre -10°C/min y -100°C/min.(9) Por lo tanto, el espermatozoide humano
puede ser congelado y descongelado exitosamente usando varios protocolos, siempre y
cuando la velocidad de congelamiento se encuentre dentro de este rango y que el
descongelamiento sea rápido. Usando la movilidad como criterio de un buen proceso de
congelamiento, se ha demostrado que hay varias técnicas que dan una muy buena
recuperación, independientemente del protocolo de congelamiento que se utilice.(10)
Almacenamiento de las pajillas
Las pajillas, después de ser colocadas directamente en el nitrógeno líquido, deben pasar a
su portapajillas “goblet” previamente identificadas e introducirse en el tanque de
nitrógeno líquido, dentro de una de las canastillas. La muestra congelada puede
permanecer ahí por varios años.
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Proceso de descongelamiento
La mayoría de biólogos frotan las pajillas entre sus manos o las mantienen a temperatura
ambiente hasta que éstas se descongelen. Otros métodos de descongelamiento son: 1)
descongelar a temperatura ambiente por 10 minutos, seguidos de 10 minutos a 37°C. 2)
descongelar en agua helada por 10 minutos seguidos de 10 minutos a 37°C. 3)
descongelar a 35°C en vapor de agua por 12 segundos seguidos de 10 minutos a 37°C; y,
por último, 4) colocar directamente las pajillas o viales en un baño maría a 37°C hasta
que se descongele la muestra.
Las técnicas de descongelamiento actuales no parecen ser un factor crítico, lo único
importante es que el descongelamiento debe ser rápido. Es importante evitar la pérdida
de movilidad espermática que resulta del shock osmótico, debido a una preparación
inadecuada del semen descongelado.
Remoción del semen de las pajillas
El número adecuado de pajillas a ser descongeladas deberá establecerse antes de iniciar el
proceso. El porcentaje de espermatozoides móviles recuperados indicará el número de
pajillas requeridas para cada caso en particular. Sólo será necesario descongelar 2 pajillas
de 0.5ml para realizar una inseminación intrauterina, si la muestra congelada contiene
alrededor de 20 millones de espermatozoides por ml. Cuando, además del
descongelamiento se va a realizar lavado de la muestra y capacitación con medio de
cultivo fresco, el contenido de las pajillas se vacía dentro de un tubo Falcon (Becton
Dickinson) que contenga gradientes discontinuos de medio como es el ISOLATE (Irvine
Scientific). Una vez que la muestra ha sido colocada en el tubo, se deja en equilibrio por
varios minutos para que todo se equilibre a temperatura ambiente antes de iniciar el
proceso de centrifugación por 10 minutos a 400g, seguido de un proceso de lavado final
con medio de cultivo fresco y equilibrado.
Las indicaciones para inseminación intrauterina con semen criopreservado son:
1. Azoospermia.
2. Oligoastenozoospermia severas, en casos de no realizarse inyección intraplásmica
del espermatozoide (ICSI)
3. Radiación o Quimioterapia.
4. Patología genética grave.
5. Isoinmunización al factor Rh.
6. Disfunción sexual.
7. SIDA.
7
Debido a que los conocimientos de la criopreservación de embriones en nitrógeno líquido
ha logrado grandes avances en los últimos años, usualmente no todos los embriones
obtenidos con el uso de las técnicas de fertilización in vitro (FIV) o inyección
intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI) son transferidos, reduciendo de forma
importante el riesgo de embarazo múltiple. Sin embargo, tanto médicos, pacientes y
público en general tienen conflictos sobre aspectos legales, morales y religiosos en
relación a la criopreservación de embriones. Tanto es así que en países como en
Alemania, Dinamarca, Austria, Suiza y Suecia(11) la congelación de embriones no está
permitida. Con objeto de evitar estas restricciones en la actualidad se sugiere como
alternativa válida la práctica de congelar y criopreservar óvulos o tejido ovárico
humanos, que podría tener como sus principales indicaciones:
1. Evitar la congelación de embriones excedentes.
2. Conservar la fertilidad en pacientes que van a ser sometidas a quimioterapia o
radioterapia por algún proceso maligno.
3. Pacientes con patología ovárica (insuficiencia ovárica prematura, endometriosis,
quistes de ovario o infecciones pélvicas).
4. Mujeres que desean diferir su maternidad por motivos profesionales, ausencia de
pareja o por enfermedades que contraindiquen el embarazo temporalmente.
5. Programas de donación de ovocitos.
La criopreservación de espermatozoides y embriones humanos conlleva menos
dificultades que la de ovocitos. Esto es debido a las características biológicas de los
mismos, y por esto se han planteado varias interrogantes: duda de inducir aneuploidia
después de que los ovocitos han estado expuestos a criopreservantes, y a los riesgos
inherentes a los procesos de congelamiento y descongelamiento. Los ovocitos se
encuentran detenidos en estado de metafase de la segunda división meiótica al momento
de la ovulación, en el cual los 23 cromosomas están unidos a los microtúbulos del huso
mitótico. En esta fase es cuando los ovocitos son extremadamente sensibles a los cambios
de temperatura, la separación normal de las cromátides al momento de la fertilización
puede ser dañada y, por lo tanto, pueden favorecer la aparición de aneuploidias después
de la extrucción del segundo cuerpo polar. Como se hace referencia en la literatura, el
bajo número de embarazos después de la criopreservación demuestra las importantes
dificultades técnicas que enfrenta este procedimiento(12-17).
Hay 5 etapas importantes en el proceso de criopreservación: 1) Exposición inicial al
crioprotector. 2) Bajar la temperatura a -0o C. 3) Almacenamiento. 4) Descongelamiento
y, por último, 5) Dilución y retiro del crioprotector con el retorno al microambiente
fisiológico normal.
Los momentos más críticos de la sobrevida celular es la fase inicial de congelamiento a
temperatura bajas y su retorno definitivo a condiciones fisiológicas. Al llegar a la
temperatura del nitrógeno líquido –196oC, el almacenamiento por largos periodos de
tiempo no tiene efecto en la tasa de sobrevida del gameto congelado.
8
Cuando un ovocito es enfriado a temperaturas que oscilan entre los –5oC y los –15oC, la
formación del hielo se induce en el medio extracelular por el proceso llamado siembra
“seeding”. Al disminuir aún más la temperatura, la cantidad de hielo aumenta y los
solutos se concentran extracelularmente. El resultado es la creación de un gradiente
osmótico. Este gradiente permite que el agua salga del citoplasma al medio extracelular,
disminuyendo de tamaño de la célula. Si este cambio es lo suficientemente lento, el paso
de una buena cantidad de agua fuera de la célula disminuye la nucleación del hielo dentro
de la célula, fenómeno que ocurre a los –15oC. La tasa de modificación del volumen
celular esta en función de su permeabilidad celular, área de la membrana y la
temperatura(18). En las células con un índice superficie/volumen pequeño, como en el
caso de los gametos, una tasa de congelamiento lenta es necesaria para permitir una
suficiente salida de agua de la célula, de tal manera que los cristales intracelulares que se
forman son tan pequeños que no lesionan los componentes intracelulares.
Variables propias del ovocito
El tamaño del ovocito influye en la tasa global de sobrevida, ya que la probabilidad de la
formación de hielo intracelular depende de ello. El espermatozoide humano ofrece un
buen ejemplo de la influencia del volumen del citoplasma en la sobrevida después de la
criopreservación, ya que son 180 veces más pequeños que el óvulo y su tasa de sobrevida
es mucho mayor.
Es necesario una buena calidad de óvulos para poder garantizar una óptima sobrevida.
Frecuentemente los óvulos sobrantes son de mala calidad y eso compromete el éxito. Por
este motivo algunos autores, como Chen(12), prefieren congelar los mejores óvulos
disponibles. Los 4 aspectos más importantes que evalúan la calidad del óvulo son: estadio
nuclear, características citoplasmáticas, aspecto de la corona radiada y la expansión o
distribución de las células del cúmulus.
Existe controversia en cuanto si se mantiene o no el cúmulus para mejorar las tasas de
sobrevida. Chen y Van Uem afirman que su ausencia facilita la introducción de la
sustancia crioprotectora en el citoplasma; tanto es así que el primer embarazo fue
producto de la congelación de un óvulo sin cumulos(12,14). También Gook ha reportado
una tasa de sobrevida mayor en ovocitos congelados sin cúmulus en comparación con los
que mantenían las células de la granulosa intactas (69% vs. 48%)(19). Pero existen
estudios que demuestran la importancia de conservar el cúmulus para garantizar una
mayor sobrevida al final del proceso de criopreservación(20-24). Al parecer, la presencia de
las células de la granulosa sirve como un escudo contra las modificaciones osmóticas
repentinas y el estrés ocasionado por la concentración y dilución de los crioprotectores
durante el proceso de equilibrio y remoción de éstos después del descongelamiento.
Los ovocitos deben ser congelados en el período más próximo a la aspiración, entre 38 a
40 horas después de la administración de la gonadotropina coriónica humana (hCG)(13).
Los ovocitos cultivados in vitro antes de la congelación tienen una reducción significativa
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en su potencial de fertilización y un incremento en fertilizaciones anormales y
poliploidias(25). Todos los embarazos que se han conseguido han sido con ovocitos
congelados en metafase II. La criopreservación de ovocitos en profase I se ha propuesto
como alternativa para la congelación de óvulos. Estos ovocitos tiene un retraso en la
meiosis y los cromosomas están dentro del núcleo. En esta etapa los ovocitos son
pequeños, indiferenciados, carecen de zona pelúcida y están en reposo desde el punto de
vista metabólico. Los estudios sobre congelación con este tipo de óvulos no han sido muy
alentadores(24). De hecho, por su baja sobrevida (37%) y tasa de maduración in vitro
(20%), los investigadores han concluido que los ovocitos en profase I que teóricamente
serían menos susceptibles al daño térmico, no representan una buena alternativa para
congelamiento.
La corteza ovárica es un tejido rico en folículos en diferentes etapas de maduración, en
particular de folículos primordiales. Es posible en la actualidad almacenar tejido ovárico
por períodos que van de 24 horas a 5 semanas usando diferentes protocolos de
congelamiento. Varios autores indican que debido al estado normal que se encuentran los
folículos en la corteza después del congelamiento y descongelamiento, el ovocitos puede
ser capaz de maduración in vitro y fertilización normales. Newton (26) y Gosden(27)
demostraron que se puede injertar en el abdomen fragmentos delgados de parénquima
ovárico que ha sido exitosamente congelados y descongelados y lograr la maduración de
folículos primordiales. Los autores concluyen que aunque hace falta más estudios sobre
la criopreservación y transplante de tejido ovárico, los reportes preliminares son
alentadores por lo que se puede sugerir el banco de tejido ovárico como un método válido
para preservar la fertilidad en casos seleccionados.
Variables técnicas y resultados
Las sustancias crioprotectoras tienen diferentes componentes químicos. Ellas comparten
una gran solubilidad acuosa, asociada con toxicidad, la cual es directamente proporcional
a su concentración y temperatura. Su papel es el de proteger a las células del daño
térmico frío o “cold shock” el cual se produce durante los procesos de congelamiento,
almacenamiento y descongelamiento de los ovocitos. Los crioprotectores se dividen en
dos categorías, dependiendo de su capacidad para penetrar en la célula: intracelulares o
extracelulares. Bioquímicamente es posible distinguir tres clases de sustancias
crioprotectoras: alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1,2 propanedil, glicerol), azúcares
(glucosa, lactosa y sucrosa) y el dimetilsulfóxido (DSMO). En la actualidad, los
protocolos más utilizados para el congelamiento de ovocitos son los lentos a base de 1,2
propanediol, debido a su mejor tasa de sobrevida y fertilización post-descongelamiento.
Hay una considerable controversia en la literatura en lo concerniente a la tasa de
sobrevida de ovocitos descongelados. Los resultados de Chen reportan una tasa de
sobrevida del 76% y son considerados como los más altos(13). Pero debe mencionarse que
Chen congela sólo ovocitos en metafase II y de excelente calidad. El promedio inferior
de las tasas de sobrevida es del 25% y son las reportadas por Al-Hasani(15) quien congeló
sólo los óvulos sobrantes y no siempre los de mejor calidad. Tasas de sobrevida del
10
34.4% reporta Kazem(11) y 24.7% Tucker(16). Gook comunicó una tasa muy variable de
sobrevida entre 48% al 95%(28). Este autor utilizó el 1-2 propanediol y observó una
excelente sobrevida congelando ovocitos sin cúmulus (69%) con respecto a los que
conservaron su cúmulus (48%). La variabilidad en los resultados puede atribuirse al bajo
número de casos de ovocitos descongelados. Sin embargo, hasta el día de hoy, Porcu
reportó un estudio con el mayor número de ovocitos descongelados y las tasas de
sobrevida variaron entre 57% y 58%(17).
La tasa de fertilización in vitro de ovocitos congelados/descongelados también es
variable: 13%(11) al 71%(13). En la mayoría de estudios la variabilidad es entre el 30% y el
55%, lo cual es inferior al obtenido en la fertilización in vitro de ovocitos frescos. Las
fertilizaciones anormales, por lo general poliploidias, varían entre el 5% al 15.3% y se
las calculó en base al número de ovocitos inseminados(15). Esta baja tasa de fertilización
y el incremento en las anomalías de la fertilización en ovocitos criopreservados se han
relacionado con el posible daño de la zona pelúcida y a los gránulos corticales, lo cual
interfiere en la interacción con el espermatozoide. Últimamente se ha propuesto la
inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI) como una solución a estos
problemas. Gook y su grupo de trabajo en 1995 obtuvieron una fertilización normal en
50% de los casos utilizando esta técnica(28). Sin embargo, se asoció con 21% de
fertilización anormal. Es importante recalcar al respecto que los embriones obtenidos por
la técnica de la ICSI demostraron una mayor capacidad de división celular, en
comparación con los obtenidos con una fertilización in vitro convencional. Hallazgos
similares fueron encontrados por Kazem quien observó una fertilización normal con la
ICSI(11) del 43.2% y por Tucker que obtuvo un 65% con 3 embarazos que resultaron
todos en abortos tempranos(16).
El protocolo para congelamiento de ovocitos se puede resumir en lo siguiente:
a) Estimulación de la ovulación con análogos agonistas de la hormona liberadora de
gonadotropinas (a-GnRH) junto con hormona folículo-estimulante
recombinante(29).
b) Protocolo de congelamiento lento con descongelamiento rápido, utilizando 1,2
propanediol más sucrosa como medios crioprotectores.
c) Remoción del cúmulus con hialuronidasa.
d) Equilibrar los ovocitos 10 minutos en sustancia salina fosfatada (PBS)
suplementada con 1.5M de 1,2 propanediol y 0.2 sucrosa.
e) Temperatura inicial 23oC, reducción de la temperatura de 20oC a –8oC a una
velocidad de –2oC por minuto. Realizar seeding manual. Reducción de la
temperatura a –30oC a una velocidad de –0.3oC por minuto y, por último,
disminución rápida de la temperatura a –150oC a una velocidad de –50oC por
minuto.
f) Colocación de los ovocitos en pajillas en nitrógeno líquido y almacenamiento.
El descongelamiento se realiza a temperatura ambiente por 30 segundos y luego se
colocan las pajillas en baño maría a 30oC por 40 segundos.
11
Porcu, utilizando este protocolo y la ICSI a los ovocitos descongelados logró fertilización
normal del 64.3%(31-33) y una fertilización anormal del 7.2%, lo cual es similar a la
reportada óvulos frescos.
Embarazos y nacimientos
En 1986 Chen reportó el primer embarazo con ovocitos descongelados y la FIV-TE(12).
Un año más tarde, dos embarazos fueron reportados por Chen y Van Uem(13,14). Diez años
más tarde el grupo de Porcu reportó el nacimiento de una niña producto de un óvulo
congelado al cual se le realizó la ICSI(17). Al momento actual, Porcu y su grupo ha
obtenido 16 embarazos y el nacimiento de 11 niños saludables(34). En la Tabla I se
observa los datos de los embarazos utilizando ovocitos descongelados.
TABLA I. Embarazos utilizando ovocitos descongelados
Autor Año Embarazos (método)
Chen (Australia) 1986
1987
2 (IVF)
1 (IVF)
Van Uem (Alemania) 1987 1 (IVF)
Porcu (Italia) 1997
1998
1999
1 (ICSI)
6 (ICSI)
9 (ICSI)
Polak (Argentina) 1998 1 (ICSI)
Tucker (USA) 1998 1 (ICSI)
Young (Argentina) 1998 3 (ICSI)
Trounson (Australia) 1999 1 (ICSI)
Lanzsendorf (USA) 1999 2 (ICSI)
CONGELAMIENTO DE EMBRIONES
La criopreservación de embriones humanos permite a las clínicas especializadas en
fertilización in vitro (FIV) y en inyección intracitoplásmica de espermatozoides (ICSI)
mejorar las tasas de embarazo y, lo más importante, ayuda a prevenir el desecho
indiscriminado de embriones sobrantes, resultantes de estas técnicas de reproducción
asistida (TRA).
Después de la estimulación ovárica generalmente se obtiene un promedio entre 10 a 12
óvulos, por lo que más de un 50% de estas pacientes tendrán embriones sobrantes para
ser congelados. El congelamiento de embriones ayuda a prevenir el desarrollo del
Síndrome de Hiperestimulación Ovárica (SHO), ya que si se sospecha que la paciente
está en riesgo de desarrollarlo, se procederá a suspender la transferencia y a congelar
todos las embriones. En caso de pacientes sometidas al programa de óvulo donado, la
12
congelación de embriones ayuda a evitar la necesidad de nuevamente requerir de una
donante y evita la sincronización entre receptora y donante. La criopreservación
embrionaria también es útil en casos de pacientes que van a ser sometidas a ciclos de
radioterapia o quimioterapia. Y por último, en casos de receptividad endometrial
inadecuada, en los que la transferencia y la tasa de embarazo se ven comprometidas.
Debido a estos factores, el congelamiento de embriones es indispensable en cualquier
clínica de fertilidad.
Las técnicas de criopreservación embrionaria han evolucionado con gran rapidez desde
que en 1983 se reportó el primer embarazo producto de estas técnicas, luego de la
transferencia de un embrión de 8 células(35). En la actualidad, los embriones son
congelados en las etapas iniciales de su clivaje: pronúcleos o embriones en día 2 de
desarrollo, usando variantes de los métodos descritos por Lasalle, que utilizan
propanediol y sucrosa.(36)
Crioprotectores
Durante el proceso de criopreservación, todas las reacciones químicas dentro de la célula
deben suspenderse. Los embriones humanos son almacenados en nitrógeno líquido a una
temperatura de -196°C; a esta temperatura el único daño que puede producirse es por
radiación ionizante y para que esto ocurra deben pasar cientos de años.(37) El daño que
ocurre con la criopreservación no es por el almacenamiento de los embriones, sino por la
formación de cristales dentro de la célula durante el proceso de congelamiento y
descongelamiento de los embriones. El uso de protocolos lentos de congelamiento evita
que ocurran estas lesiones al igual que la utilización de sustancias crioprotectoras como el
propanediol, dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol. Los protocolos lentos reducen la
velocidad a la que se pierde el agua celular, con el consecuente aumento en la
concentración de sales que resultan de la formación de cristales de hielo en el medio
adjunto.
Los protocolos más nuevos y efectivos utilizan la congelación de embriones en
pronúcleos o en etapas tempranas de clivaje y utilizan propanediol como crioprotector, el
mismo que ingresa a la célula de forma rápida en combinación con sucrosa, lo que causa
que el agua abandone la célula.(36) Este crioprotector y esta técnica han reemplazado a
los protocolos rápidos y ultrarrápidos (vitrificación) que utilizaban el DMSO, sustancia
mucho más tóxica para el embrión y con resultados no muy alentadores. Tabla II.
13
TABLA II. Comparación entre diferentes métodos de congelamiento de embriones
Autor Estadío Método Sobrevida
%
Ciclos
Transferidos
Emb/Transf
Wright
1990
PN a 28 hrs PG + 0.1M
Sucrosa
64 69 13
Wright
1990
PN a 35 hrs PG + 0.1M
Sucrosa
67 26 39
Vander Elst
1995
Clivaje
Temprano
PG + 0.9M
Sucrosa
32 46 4
Vander Elst
1995
Clivaje
Temprano
DMSO 53 44 18
Hartshome
1991
Blastocisto Glycerol 52 134 14
Los procedimientos de congelamiento requieren de nitrógeno líquido. La cantidad de
nitrógeno depende de los protocolos utilizados, de las características de la máquina de
congelación, del tamaño y especificaciones de los tanques de almacenamiento, y de la
frecuencia con la que se van a congelar los embriones. Generalmente se usan de 20 a 100
litros por semana. Debido a que el manejo de nitrógeno líquido es peligroso, éste debe
usarse con mucho cuidado. El gas del nitrógeno puede producir asfixia de seres vivos,
por esto los tanques deben estar en un área bien ventilada, para que el gas pueda
evaporarse sin problemas. Es importante utilizar protección para las manos y ojos, a fin
de prevenir quemaduras por congelamiento. En la actualidad, tanto los ovocitos como
los embriones son almacenados en fase líquida del nitrógeno líquido, si hubiere algún
riesgo de que las muestras para ser congeladas tengan agentes infecciosos como
Hepatitis B, éstas se deben almacenar en vapor de nitrógeno líquido o a temperaturas tan
bajas como -140 a -150 °C. Al comprar un tanque de nitrógeno se debe tener en mente su
capacidad de almacenamiento, peso, la anchura de la entrada y si los tejidos van ha ser
almacenados en portapajillas o canastillas.
Pajillas o tubos para congelación
Generalmente los embriones son criopreservados en pajillas, tubos plásticos o en viales
de vidrio. En CEMEFES se utilizan pajillas de 0.25 ml, las cuales se consiguen en el
exterior con varios distribuidores de insumos de veterinaria. Generalmente no se
esterilizan las pajillas de plástico antes de usarlas, ya que se ha visto que la esterilización
14
con radiación puede causar efectos deletéreos en las propiedades de congelación de la
pajilla. Pero en caso de que se requiera su esterilización, es conveniente hacerla con
óxido de etileno. Las pajillas son selladas por calor, alcohol polivinilo con agua o polvo
de polivinilpirrolidona. Las pajillas deben ser identificadas con el nombre de la paciente,
número de embriones en la pajilla, número y fecha del congelamiento.
Sustancia crioprotectora
En el CEMEFES utilizamos el FREEZE KIT 1 de Vitrolife - Suecia, que contiene
propanediol a diferentes concentraciones molares, y diversas concentraciones de sucrosa.
Hemos elegido este medio ya que utilizamos un protocolo lento para congelamiento,
debido a que éste protocolo junto con el mencionado crioprotector dan como resultado
mejores tasas de sobrevida post-descongelamiento, menos efectos tóxicos para el
embrión y mayores tasas de embarazo, en comparación con protocolos rápidos o
ultrarrápidos con DMSO.
Otros equipos
También se requiere de: 1) lápices con puntas finas para marcar las pajillas, canastillas,
etc. 2) Cronómetros con alarma de cuenta regresiva. 3) pipetas Pasteur estiradas al fuego
para movilizar los embriones de solución a solución. 4) Pinzas de traslado para movilizar
las pajillas dentro del nitrógeno líquido. 5) Jeringa de insulina con un adaptador especial
de silicona para cargar los embriones en las pajillas.
Si se utilizan protocolos lentos es indispensable contar con una máquina de
congelamiento específica. En CEMEFES utilizamos la Freeze Control CL 183
(Cryologic Pty, Mt Waverly, Australia)Figura 1 . Esta máquina es muy versátil y tiene la
ventaja de poder seleccionar hasta 8 programas de congelamiento diferentes, ya sea para
pronúcleos, embriones en 4 células, blastocisto o espermatozoides.
FIGURA 1. Equipo para congelación de embriones Cryologic
15
Consideraciones generales
Todos los protocolos necesitan de los materiales antes mencionados y de medio de
cultivo equilibrado a 5% CO2 y 37°C, donde los embriones son colocados después del
descongelamiento. Es importante seguir las siguientes reglas para un congelamiento y
descongelamiento exitoso:
1) Siempre identificar claramente las pajillas y canastillas con un marcador
permanente antes de iniciar la congelación y llenar la ficha de congelamiento de
la paciente.
2) Todos los embriones deben ser movilizados en forma tal que sea mínima la
cantidad de medio que éstos lleven. Esto se consigue con una pipeta Pasteur
estirada a la llama con un diámetro externo que permita sólo el paso del embrión.
3) Siempre utilizar pipetas nuevas para cada solución.
4) Verificar el nivel de nitrógeno en los tanques de almacenamiento y en el tanque
de nitrógeno líquido para el proceso de congelamiento.
5) Colocar los embriones en la parte media de la pajilla, con protección de aire y de
medio en ambos extremos. Se recomienda sellar ambos extremos de la pajilla para
evitar la entrada de nitrógeno líquido a su interior. Figura 2. SOL CONG SOL + EMB SOL CONG SOL CONG + ALG
AIRE AIRE AIRE SELLANTE
FIGURA 2. Pajilla de 0.25ml para congelamiento de embriones.
Protocolo lento con Propanediol para embriones humanos.- Este protocolo es el más
adecuado para embriones en etapa de pronúcleos o en etapas tempranas de clivaje (4
células). Los embriones se equilibran en propanediol y son congelados de forma lenta en
pajillas. Su descongelamiento es rápido y son re-hidratados en varios pasos. En la Tabla
III se puede observar el proceso de congelamiento que dura generalmente de 2 a 3 horas y
el descongelamiento de 45 a 60 minutos.
TABLA III. Programa de congelamiento lento utilizado en el CEMEFES
Programa lento
Etapas
Temperatura
Inicial
Velocidad de
Congelamiento (°C/min)
Temperatura
deseada (°C)
Espera
(min)
1 24 °C 2 0 0
2 1 -6 10
3 0.30 -35 F
16
Este protocolo empieza con una temperatura inicial de 24°C. Luego la velocidad de
congelamiento inicial es de 2°C/min hasta 0°C, aquí entra la segunda rampa de la
programación en la que la velocidad de congelamiento es de 1°C/min hasta una
temperatura de –6 °C. En este instante la máquina está programada para que se detenga
10 minutos antes de continuar con el programa. Es aquí donde se realiza el “seeding”
manual con pinzas frías que favorece la formación de hielo extracelular, evitando el daño
a los embriones. Una vez pasados los 10 minutos de espera, el programa continúa a una
velocidad de congelamiento de 0.30°C/min hasta los -35 °C y al llegar a esta temperatura
se produce una caída rápida de la misma hasta los –150 °C . Finalmente, al terminar el
programa las pajillas son almacenadas directamente en los tanques de nitrógeno líquido.
Figura 3.
FIGURA 3. Tanque de nitrógeno líquido para
almacenamiento de embriones.
Descongelamiento.- Antes de empezar el descongelamiento se deberá tener listos los
platos de cultivo, baño maría a 30°C, tijeras, jeringa con adaptador de silicona y un
cronómetro. Se utiliza un plato de 4 pozos (Nunclon Surface cat no. 176740, Nunc Brand
Products, Dinamarca), conteniendo cada pozo 0.6 ml de las siguiente soluciones:
Solución 1: 1.0 M Propanediol + 0.2 M sucrosa
Solución 2: 0.5 M Propanediol + 0.2 M sucrosa
Solución 3: 0.2 M sucrosa
Solución 4: Sustancia salina fosfatada (PBS)
En la actualidad utilizamos el medio Thawing Kit 1 (Vitrolife – Suecia), que contiene las
soluciones adecuadas en proporciones precisas para el proceso de descongelamiento.
1. Después de haber identificado las pajillas a ser descongeladas, se mantienen éstas
en un recipiente con nitrógeno líquido hasta que el proceso se inicie.
2. Se exponen las pajillas a temperatura ambiente por 30 segundos. Durante este
tiempo se verifica que las pajillas no tengan fisuras o rupturas.
3. Se colocan las pajillas a 30°C en baño maría por otros 30 minutos Se limpia la
pajilla exteriormente. Se corta un extremo de la pajilla con tijera y se le conecta la
17
jeringa con adaptador de silicona y luego se corta el otro extremo teniendo
cuidado de no mover en exceso la pajilla.
4. A continuación se expelen los embriones en la solución 1, observando que sean
depositados en este medio. En caso de que no se los observe se procede a enjuagar
la pajilla con el medio antes descrito, ya que en ocasiones los embriones se
adhieren en las paredes de la pajilla. Los embriones deberán ser incubados en este
primer medio durante 5 minutos y es muy importante recordar que los embriones
están osmóticamente muy sensibles, por lo que el manejo debe ser cuidadoso.
5. Se trasladan los embriones a la solución 2 durante 5 minutos.
6. Se colocan los embriones a solución 3 durante 10 minutos.
7. Por último, se pasan los embriones a solución 4 que contiene PBS durante 5
minutos. No se debe colocar los embriones todavía en la incubadora, debido a que
la capacidad amortiguadora del PBS es insuficiente en una atmósfera de 5%
CO2.
8. Los embriones entonces son colocados en medio equilibrado desde la tarde
anterior, ya sea IVF medium, G 1.2 o G 2.2(embrión de D-3) para verificar su
sobrevida y morfología al día siguiente y prepararlos para la transferencia.
Dependiendo de la historia clínica de la paciente, los embriones descongelados son
transferidos al útero en un ciclo menstrual natural con el debido monitoreo, o en un ciclo
sustitutivo usando o no supresión ovárica asociado con preparación hormonal del
endometrio.
Ciclo natural.- La transferencia de embriones descongelados en un ciclo natural se
recomienda en pacientes jóvenes con ciclos menstruales regulares. Se solicita a las
pacientes que acudan a la clínica a partir del día 8 del ciclo para realizar un seguimiento
folicular estricto con ultrasonidos periódicos, determinaciones de estradiol, LH y
progesterona. Los embriones se transfieren 3 días después de detectarse el pico de LH.
No se recomienda dar apoyo a la fase lútea.
Ciclo sustituido.- En mujeres mayores de 35 años o en mujeres con ciclos irregulares, se
recomienda lograr una supresión hipofisiaria usando agonistas de la hormona liberadora
de gonadotropina (a-GnRH), (Lupron Inyection Abbott USA). Se inicia con dosis s.c. de
20 U diarias desde el día 21 del ciclo anterior a la transferencia. En pacientes
amenorréicas el agonista se puede empezar cualquier día. En el segundo día del ciclo
después de la administración del agonista, se confirma el estado de supresión ovárica con
ultrasonido y determinaciones séricas de progesterona y estradiol.
Al confirmarse la quiescencia ovárica se puede reducir la dosis del agonista a la mitad y
empezar el reemplazo hormonal con 17 Beta estradiol (Estrace 2 mg, tabletas, Mead –
Johnson, USA): 8 días consecutivos de 2mg, los 3 días siguientes con 4mg y, por último,
6mg del 12o día de reemplazo en adelante. La progesterona se inicia después de 14 días
de haber tomado el estradiol y en caso de que el endometrio sea favorable para la
18
implantación, es decir, mayor de 7 mm de grosor por estudio ecográfico. La progesterona
utilizada es natural micronizada por vía vaginal a dosis de 400mg/ al día (Utrogestan,
Besins – Iscovesco de París – Francia, o Geslutin, Medicamenta Argentina; perlas de 100
mg). Después de 4 días de progesterona se procede a descongelar los embriones y al 5to
día se realiza la transferencia, siempre y cuando los embriones hayan sobrevivido. La
administración de estos medicamentos se continuará hasta que se realice la prueba de
embarazo, 14 días posteriores a la transferencia. En caso de ser positiva la fracción beta
de la gonadotropina coriónica humana (B-hCG), se continúa la medicación hasta la 10o
semana de gestación.
RESULTADOS DE LOS PROGRAMAS DE CONGELAMIENTO DE EMBRIONES
Existen diferentes factores que afectan el pronóstico de la transferencia de embriones
descongelados, en particular la edad de las pacientes y el número de embriones
disponibles para transferir. En un estudio de 1340 ciclos de transferencias de embriones
congelados en la clínica Bourn Hall entre 1991 y 1996, se mencionaron estas causas
como las más importantes La Tabla IV muestra el efecto de la edad en el pronóstico de
embarazo en esta serie. Las tasas de embarazo disminuyeron significativamente en
pacientes mayores de 40 años, pero por debajo de los 40 años la edad aparentemente no
influye. Sin embargo, las tasas de embarazo en pacientes mayores de 40 años son
superiores que en los casos de transferencia de embriones frescos.
TABLA IV. Relación entre la edad de las pacientes
y el pronóstico de los embriones congelados
Edad (años)
Número de ciclos
Embarazos
N %
Menores 25 15 3 20
25-30 283 67 23.7
31-35 585 137 23.4
36-40 342 88 25.7
Mayores 40 115 14 12.2
La Tabla V muestra la relación entre el número de embriones transferidos y las tasas de
embarazo. Se observa que existe una tasa más baja de embarazo cuando se transfiere un
embrión, pero no se modifica si se transfieren entre 2 ó 3 embriones.
19
TABLA V. Tasas de embarazo en relación con el número de
embriones transferidos
Número de embriones
transferidos
Total de
embriones
Embarazos
N %
1 138 10 7.2
2 351 74 21.1
3 851 225 26.4
En la Tabla VI se analiza la tasa de embarazo clínico de acuerdo al número de embriones
descongelados y transferidos, según el último reporte de la Red Latinoamericana de
Reproducción Asistida de 1999(40).
TABLA VI. Tasa de embarazo por número de embriones criopreservados
transferidos(40)
Número de
embriones
Número de
Transferencias
Tasa de Embarazo
(%)
Uno 124 11.6
Dos 220 13.6
Tres 278 20.1
Cuatro 217 26.7
Cinco 91 28.6
Seis o más 48 14.6
Total 978 18.5
CONCLUSIONES
EL congelamiento y descongelamiento de embriones humanos aumenta el potencial de
embarazo de las parejas sometidas a un programa de IVF o ICSI. Si se tiene el cuidado
necesario, las tasas de embarazo producto de su transferencia pueden ser iguales a las de
embriones frescos. Se han realizado varios análisis y se ha establecido que se pueden
conseguir tasas de embarazo de hasta el 50% por ciclo de IVF/ICSI si se combinan con
congelamiento de embriones(38,39). Por todo esto, con el objeto de ofrecer lo mejor a la
pareja infértil, se debe contar con un programa de congelamiento de embriones adecuado
y se considera esencial en cualquier clínica de reproducción asistida. El comité de ética
de la Asociación Americana de Medicina Reproductiva (ASRM), en un debate sobre
ética de los embriones criopreservados concluyó que: “las ventajas son tan amplias a este
concepto, que toda clínica de reproducción debería tener programas de congelamiento de
embriones ya que sus ventajas son: disminución de los costos al no tener que repetir un
nuevo ciclo de estimulación ovárica, disminución del riesgo de embarazo múltiple y
20
disminución del número de ciclos de aspiración de ovocitos para lograr un embarazo por
FIV/ICSI.”
Últimamente, existe una tendencia a prevenir los embarazos múltiples y se ha sugerido
que se debe limitar el número de embriones transferidos a 2 ó máximo 3. El uso de la
criopreservación de embriones hace esta conducta más realista, ya que las pacientes
pueden congelar sus embriones para futuras transferencias sin que la tasa de embarazo
disminuya. Sin embargo, es muy importante que los programas de congelamiento de
embriones sean bien manejados, poniendo mucha atención a la seguridad en términos de
evitar contaminaciones del nitrógeno líquido y que la clínica esté en contacto constante
con las parejas responsables de los embriones. Para este fin y debido a que no existe una
legislación sobre el uso y derechos de los embriones congelados, es importante que la
pareja firme un consentimiento informado donde se mencione todo lo referente al proceso
de congelación y almacenamiento de los embriones, así como los costos y tiempo que los
embriones deben ser mantenidos en los tanques de nitrógeno líquido.
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Tem alguma dúvida?
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)