COVID-19 REDLARA: LIvros (Reproducción Humana e Infertilidad)
Inyección Intracitoplásmica de Espermatozoides (ICSI)
O Microinyección Espermática Intraovular (MEI): Experiencia en El Ecuador. Iván Valencia Madera, Pablo Valencia Ll., Nelson Paz y Miño E. INTRODUCCIÓN ASPECTOS CLÍNICOS E INDICACIONES DE LA ICSI O MEI ESPERMATOCITOS SECUNDARIOS TECNOLOGÍA DE LA ICSI O MEI FECUNDACIÓN NORMAL LUEGO DE LA ICSI RIEGOS PONTENCIALES DE LA ICSI NÚMERO TASA DE EMBARAZO REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Desde el advenimiento exitoso de la fertilización in vitro y transferencia embrionaria
(FIV-TE) en 1978(1) para el tratamiento de pacientes con factor tubárico irreversible
exclusivamente, en un principio, y posteriormente para algunos casos de endometriosis
pélvica, esterilidad sin causa aparente (ESCA) y factor masculino moderado, se ha
producido un vertiginoso desarrollo de tecnologías de reproducción asistida (TRA).
Estas tecnologías han sido encaminadas a solucionar aquellos casos de pacientes con
parámetros seminales que no cumplen con los requisitos mínimos establecidos por la
Organización Mundial de la Salud (OMS)(2) y que constituían un considerable número
de parejas incapaces de alcanzar un embarazo a través de la FIV-TE debido
principalmente a una falla en la fertilización.
Es así como se han desarrollado varias técnicas de micromanipulación de gametos que
pretenden salvar el obstáculo que representa la zona pelúcida en unos casos o de
facilitar la implantación embrionaria en otros: Disección parcial de zona (PZD),
inserción subzonal del espermatozoide (SUZI), “hatching” asistido(3,4), etc., sin que
ninguno de ellos obtenga tasas de fertilización exitosas y además van asociados a
importantes tasas de polispermia.
Cabe mencionar que estas técnicas se originaron a partir de tecnologías de
micromanipulación preexistentes que fueron aplicadas para otros propósitos, pero
nunca para fertilización asistida.(5) Desde el inicio del siglo veinte los científicos
intentaron desarrollar varias técnicas con manipulación directa de células vivas bajo
visión microscópica.(6) En 1928 Emmerson(7) describe el primer manipulador provisto
de una manija diseñada para posibilitar una transmisión directa de los movimientos
requeridos por el operador. En 1934 de Fonbrune (8) relató los principios hidráulicos
capaces de utilizarse en las manijas de micromanipuladores y, además, desarrolla las
microherramientas para la fabricación de microforjas que todavía son utilizadas
actualmente.
De esta manera las técnicas de micromanipulación se fueron desarrollando
gradualmente en el siglo pasado y han alcanzado tal grado de precisión que en los
actuales días permiten a los investigadores la microdisección de un cromosoma. En el
campo de la reproducción humana, la aplicación de la inyección intracitoplásmica de
espermatozoides (ICSI)(9) o microinyección espermática intraovular (MEI) por parte de
Palermo y colaboradores en 1992 fue el acontecimiento que rompió las barreras en el
campo de la fertilización asistida, sobretodo con relación a la problemática de la
infertilidad masculina. Ella ha permitido al embriólogo obtener un íntimo contacto con
el ovocito y el espermatozoide y dado que cada gameto es manipulado individualmente,
le ha permitido trabajar con el citoplasma del ovocito, situación que no sucede con la
FIV convencional, y le ha abierto un espacio maravilloso en el estudio e investigación
del gameto femenino.
2
La técnica consiste en lograr la penetración directa de un espermatozoide en el interior
del ooplasma mediante una pipeta de microinyección; se trata pues del método más
invasivo desarrollado en la actualidad y por tanto, sus potenciales riesgos deben ser
tenidos siempre en cuenta, y requerirá aún de múltiples investigaciones futuras que
sobrevendrán con la experiencia adquirida. Cabe mencionar que esta técnica fue
aplicada desde 1966(10) por Hiramoto en experimentos con gametos de animales
invertebrados, con objeto de demostrar que la descondensación nuclear espermática y la
formación del pronúcleo masculino no requieren de una interacción previa entre el
espermatozoide y las membranas ovocitarias. Varios experimentos posteriores,
utilizando como modelo al conejo, consiguieron además el consiguiente clivaje
embrionario y el nacimiento de crías normales(11,12) en 1988-89.
En la especie humana, el primer reporte de la ICSI lo inició Lazendort y cols en 1988(13)
demostrando que los ovocitos son capaces de sobrevivir a la microinyección y
consecuentemente a la formación de pronúcleos masculino y femenino, hasta el famoso
reporte de Palermo y cols en 1992 de los primeros embarazos y nacimientos exitosos.
En definitiva, se trata de una técnica de FIV modificada que implica la introducción
directa de un espermatozoide en el interior del citoplasma del ovocito, mediante los
recursos que proporciona un sistema complejo de micromanipulación y que tiene que
ser implementado en un programa de reproducción asistida exitoso previamente
existente con todo el equipamiento adecuado, requerimientos ambientales esenciales y
la habilidad necesaria para el manejo de gametos, como factores fundamentales para el
cultivo in vitro de ovocitos y embriones. Cabe mencionar al respecto el relevante
comentario de Schmidt en 1959(14), en relación al uso de la disección microscópica:
“Para manejar el instrumento de forma exitosa se requiere de delicadeza en el tacto y
mucha paciencia, ya que los hechos científicos han establecido o alguna vez
establecerán que únicamente la paciencia combinada con perseverancia, energía y
observaciones frecuentes son indispensables”.
La experiencia juega un papel decisivo para lograr el éxito con esta técnica, siendo
común iniciar con bajas tasas de fertilización en los primeros ciclos, que mejorarán con
la práctica adquirida y a medida que los problemas iniciales se vayan superando. El
empleo de la ICSI requiere indiscutiblemente de una curva de aprendizaje antes de
alcanzar resultados satisfactorios(15). Se ha mencionado que debe optimizarse la técnica
para lograr tasas de fertilización y embarazos estables y exitosos con un número de
ciclos cercanos al centenar, es decir luego de microinyectar 1.000 ovocitos(16)
1. FACTOR MASCULINO SEVERO
Procedimientos de reproducción asistida como la inseminación intrauterina con sus
variables técnicas y la FIV-TE, se convirtieron en tratamientos convencionales para
pacientes con infertilidad masculina de larga duración, cuando las terapias específicas
no estaban disponibles o habían fallado. Sin embargo, los logros alcanzados eran
limitados, tanto porque requieren de un adecuado número de espermatozoides
funcionales, así como de una normal interacción de los gametos(17). En la mayoría de los
casos de infertilidad masculina de larga data, escaso número de espermatozoides están 3
disponibles y aquí la introducción de la ICSI ciertamente ha revolucionado el
tratamiento de estos pacientes, convirtiéndose en la actualidad en la más poderosa
alternativa disponible de reproducción asistida para el manejo de una infertilidad
masculina severa, e inclusive como primera opción en aquellos casos de infertilidad
masculina moderada de larga duración en los cuales no se dispone de un tratamiento específico.
El factor masculino severo se lo define por la presencia de menos de 500.000
espermatozoides móviles progresivos en el total del eyaculado(16), algunos especialistas
mencionan una cifra de menos de 100.000 espermatozoides(5), y en la ICSI los criterios
globales de valoración espermática no influyen en la tasa de fertilización(18), ya que sólo
se necesita un número suficiente de espermatozoides móviles para la microinyección de
todos los ovocitos. Además, basta con la recuperación de espermatozoides con cualquier
tipo de movilidad que garanticen su vitalidad.
1.1 Oligoastenozoospermia severa.- Probablemente se ha constituido en la indicación
más socorrida para la ICSI por lo que ha sido extensa y exitosamente utilizada en
estos casos, comprobándose a cabalidad(19) que se trata del más eficiente
tratamiento para aquellos hombres con muy escasos espermatozoides vivos e
incluso azoospermia oculta. La utilización de la ICSI en pacientes con parámetros
seminales limítrofes también alcanza una significativa tasa de fertilización superior
que con la FIV convencional(20,21) utilizando ovocitos de la misma cohorte e
inclusive, sólo ante la sospecha de factor masculino de infertilidad.
1.2 Astenozoospermia total.- La ausencia completa de movilidad espermática puede ser
resultado de diferentes condiciones(17): síndrome de cilia inmóvil, defectos
enzimáticos o funcionales de la porción flagelar del espermatozoide, masiva
infección seminal por Escherichia coli, presencia de anticuerpos inmovilizantes
antiespermatozoides, infección de las glándulas accesorias masculinas como por
ejemplo, prostatitis crónica, etc., que ocasionalmente pueden asociarse a
necrozoospermia. Estos pacientes requieren ser sometidos a exámenes paraclínicos
adecuados y al tratamiento específico y posteriormente a pruebas de vitalidad
espermática como la prueba hipoosmótica (Host Test) en especial, que permitirá la
selección de espermatozoides vivos para la microinyección. Si bien se han
conseguido embarazos y nacimientos luego de la fertilización por la ICSI de
espermatozoides totalmente inmóviles(22,23), su tasa de fertilización es sumamente
baja por lo que esta condición es un factor pronóstico adverso.
1.3 Azoospermias Obstructiva y No Obstructiva.- Primeramente cabe mencionar que
en ciertos casos de pacientes azoospérmicos que participan en los programas de
TRA, es posible el hallazgo de un número limitado de espermatozoides móviles en
el sedimento de la muestra del eyaculado, cuando ésta en su totalidad ha sido
sometida a una centrifugación prolongada y/o preparación del semen y es
examinada cuidadosamente, condición conocida con el calificativo de
criptozoospermia(24) Más frecuentemente la criptozoospermia es el resultado de una
disfunción testicular primaria, pero ocasionalmente éstos pacientes pueden tener
una espermatogénesis normal pero una obstrucción parcial sea a nivel epididimario
o de los conductos eyaculatorios puede provocarla, de ahí que un apropiado manejo
clínico por parte del andrólogo y/o urólogo a través de un tratamiento antibiótico
para solucionar una prostatitis crónica o en raros casos una cirugía endoscópica para la resección del verumontanum prostático, pueden restaurar la permeabilidad de la 4
vía eyaculatoria. La recuperación en éstos pacientes de por los menos 10
espermatozoides móviles puede ser suficiente para someterlos a la ICSI y evitan
procedimientos quirúrgicos para recuperación de espermatozoides epididimarios o
testiculares que, aunque mínimo, supone traumatismo y/o riesgos potenciales.
También está indicada en casos del síndrome de Sertoli solo o aplasia de células
germinales, el cual es una falla testicular con función intersticial normal y
presencia de infertilidad y azoospermia; se acompaña con concentraciones normales
de LH y testosterona y elevación de la FSH. En casos de azoospermia obstructiva la
ICSI es la técnica de elección al posibilitar el uso de recuperación microquirúrgica
de espermatozoides del epidídimo y del testículo (25,26,27) y es así como a parir de
1993 se han ingeniado diversos métodos quirúrgicos de recuperación espermática
(Fig 1), siendo los principales:
RETA: Aspiración de rete testis.
PESA: Aspiración percutánea del epidídimo.
TESA: Aspiración testicular de espermatozoides.
SPAS: Aspiración de espermatocele.
MESA: Aspiración microquirúrgica de
espermatozoides epididimarios.
TESE: Extracción testicular de espermatozoides.
FIGURA 1: Métodos quirúrgicos de recuperación de espermatozoides
La MESA fue en 1985 (29) el primer método descrito para la recuperación quirúrgica de
espermatozoides en casos de azoospermia obstructiva y entre 1994 y 1996 se reportaron
altas tasas de fertilización y embarazos combinándolo con la ICSI (26,27,30,31), sin
embargo, es una técnica laboriosa, requiere anestesia general, especial habilidad y
equipamiento, por lo que resulta con cierto grado de trauma y morbilidad postoperatoria.
Por estas razones la PESA fue introducida en 1995(32) siendo un
procedimiento más simple que puede ser realizado bajo anestesia local y ha ganado
adeptos alrededor del mundo, a pesar de que la punción ciega del delicado y bien
vascularizado epidídimo ha sido fuertemente criticada como una técnica potencialmente
mutilante. Sus indicaciones más ampliamente aplicadas son en casos de ausencia de
vasos deferentes y en azoospermia por obstrucción adquirida, dentro de las cuales esta
la vasectomía.
A partir de 1993 que Craft y cols(33) describieron la capacidad fertilizante de
espermatozoides testiculares y en aquellos pacientes con ausencia o fibrosis de
epidídimo puede recuperarse al gameto a través de una biopsia testicular para la ICSI;
posteriormente el uso de la combinación TESE-ICSI se ha expandido, incluyendo casos
de azoospermia no-obstructiva secundaria a una severa falla de la espermatogénesis(34,35)
Debido a que la recuperación de espermatozoides tanto del epidídimo como del testículo
son procedimientos relativamente complejos y proporcionan cierta incomodidad en los
5
pacientes, es importante la criopreservación de los espermatozoides supernumerarios
para futuro uso, y a pesar de que la congelación de espermatozoides testiculares
generalmente se dificulta debido a su escaso número y pobre movilidad, varios reportes
de fertilización y embarazos(36) utilizando espermatozoides congelados-descongelados
con la ICSI se encuentran en la literatura médica. Más aún, recientemente Cohen y
cols(34) lograron recuperar exitosamente un escaso número de espermatozoides
descongelados luego de mantenerlos criopreservados en el interior de una zona pelúcida
vacía.
1.4 Factor Masculino Inmunológico.- Utilizando la ICSI es casos de presencia
importante de anticuerpos antiespermatozoides, es posible lograr resultados
satisfactorios(41)
1.5 Casos de Espermatozoides con Acrosomas Anormales o Ausentes(43,44).
2. FALLA PREVIA DE FERTILIZACIÓN
En aquellos pacientes con falla total de fertilización en ciclos convencionales previos de
FIV e independientemente de la etiología presente, la primera opción terapéutica es la
ICSI. La realización de intentos futuros con FIV apenas alcanzan tasas de fertilización
inferiores al 20-25%(38) mientras que éstas son muy superiores cuando se realiza la ICSI
en el siguiente ciclo de tratamiento. Si bien algunas clínicas especializadas
microinyectan a las 22 a 30 horas ovocitos que no han fecundado en una FIV
convencional con el exclusivo propósito de determinar finalidades pronósticas para futuros tratamientos con la ICSI, Lundin y cols(39) ya han reportado embarazos y nacimientos exitosos. Por lo tanto, actualmente se puede considerar que la ICSI de
ovocitos no fertilizados podría proporcionar un recurso de reserva para recuperar
ovocitos que fracasaron con la FIV convencional dado que el procedimiento
proporciona similares tasas de fertilización y clivaje que cuando se realiza la ICSI de
primera intención. A pesar de que se obtiene un mayor porcentaje de blastómeras
multinucleadas que se asocia con una alta tasa de anomalías cromosómicas(42), hace que
los embarazos resultantes sean menos viables.
3. ESTERILIDAD SIN CAUSA APARENTE (ESCA)
La infertilidad inexplicada tratada con FIV convencional en un elevado número de casos
resulta en una falla total de fertilización. Se han reportado(40) tasas de fertilización
significativamente superiores usando la ICSI con la misma cohorte de ovocitos
aspirados.
4. TRASTORNOS EYACULATORIOS
Orientada especialmente al tratamiento de la eyaculación retrógrada, reportándose
resultados satisfactorios. (53)
5. FACTORES OVOCITARIOS
Particularmente en referencia a pacientes malas respondedoras a la hiperestimulación
ovárica controlada (HOC) en las que se recuperan no más de 4 a 5 ovocitos por ciclo,
con objeto de asegurar la mayor fertilización exitosa posible y la disponibilidad de más 6 embriones transferibles(16). Recientemente además, se ha sugerido su utilización ante la
presencia de ovocitos anormales ya que la ICSI ha revelado un “factor ovocitario”
subestimado como causa de infertilidad; en efecto, el procedimiento ha permitido una
mejor estimación de la calidad ovocitaria y Mansour y cols.(45) han encontrado que
aproximadamente en el 6.6% de todos los ciclos es posible diagnosticar una morfología
anormal en los ovocitos recuperados que representan el 5.7% de todos los ovocitos
microinyectados. Se ha observado que ciertos ovocitos son morfológicamente maduros
pero poseen una anormal estructura de su zona pelúcida. Sin embargo, estudios
posteriores(46) han concluido que las aberraciones morfológicas de los ovocitos humanos
(probablemente a consecuencia de la HOC) tienen escasa o ninguna consecuencia sobre
la fertilización o el clivaje temprano después de la ICSI, dejando un campo abierto de
investigación para determinar su beneficio o no en estos casos.
6. OTROS FACTORES SEMINALES
En pacientes sometidos a radio y/o quimioterapia que previamente han criopreservado
su semen y en los cuales se tratará de utilizar el mínimo número de unidades para hacer
posible una cantidad mayor de ciclos con la muestra disponible. Otra situación sería
aquellos casos de falla en la recolección de semen el día de la aspiración folicular en un
ciclo de FIV y no se dispone de una muestra criopreservada, en cuyo caso una MESA-
ICSI sería una posible solución. También en teratozoospermia severa, con menos del
2% de formas normales, valorado con criterios estrictos.(5)
7. ICSI EN OVOCITOS HUMANOS MADUROS CRIOPRESERVADOS(47)
8. ICSI EN OVOCITOS HUMANOS INMADUROS LUEGO DE SU PROCESO DE
MADURACIÓN IN VITRO(48)
9. ICSI UTILIZANDO TEJIDO TESTICULAR CRIOPRESERVADO(49)
10. ICSI UTILIZANDO ESPERMÁTIDES ELONGADAS Y REDONDAS(50,51) Y AÚN
Hiperestimulación Ovárica Controlada (HOC).- El esquema de estimulación ovárica
más ampliamente utilizado para el tratamiento de la infertilidad masculina mediante la
ICSI, es la administración de un agonista de la GnRH (acetato de Leuprolide: Lupron,
Abbott, USA) a dosis de 1mg SC diario en protocolo largo que inicia el día 21 ó 22 del
ciclo menstrual previo y, luego de alcanzar el estadio de quiescencia ovárica, se
empieza la inyección SC ó IM de gonadotropinas humanas (HMG, FSH urinaria
altamente purificada ó preferentemente FSH recombinante) a partir del 2o ó 3o día de la
menstruación. Se debe individualizar la dosificación de acuerdo a la respuesta de cada
paciente y según los resultados de los controles realizados a través de la ecosonografía
transvaginal y la cuantificación sérica del estradiol. Cuando un mínimo de 5 folículos
alcanzan un diámetro mayor a 20mm se aplica intramuscularmente 10.000 UI de
hormona gonadotropina coriónica humana (HCG), y la recuperación ovocitaria se la
efectúa de 36 a 38 horas más tarde mediante punción transvaginal guiada por
ultrasonido. 7
La principal ventaja de usar agonista GnRH en protocolo largo, además de prevenir el
pico endógeno de la hormona luteinizante (LH) y el síndrome de hiperestimulación
ovárica, es la de obtener un significativo mayor número de ovocitos maduros en
comparación al que se obtiene con un protocolo corto o ultracorto y a los esquemas de
HOC más simples, que administran gonadotropinas únicamente o asociados con citrato de clomifeno (CC). Siguiendo esta conducta será posible recuperar de 12 a 15 ovocitos viables para la
microinyección, disponer de suficiente número de embriones para la transferencia al
útero y de embriones supernumerarios adecuados para la criopreservación.
Preparación de los ovocitos.- Para una óptima visualización y precisa inyección
intracitoplásmica en el ovocito, los complejos cúmulus-corona deben ser denudados, es
decir realizar la remoción del cúmulus de células de la granulosa que rodean al ovocito, para lo cual procedemos de la siguiente manera a las 3 a 4 horas después de su
recuperación: a) doble lavado del complejo en medio Gamete-Hepes (Vitrolife, Suecia);
b) cultivo en plato Nunc de cuatro pozos (Nunclon-Dinamarca) en medio IVF
(Vitrolife-Suecia) y cubiertos con aceite mineral para cultivo de embriones (Irvine
Scientific, USA); c) denudación del complejo mediante maniobras mecánicas con el
auxilio de pipetas Pasteur de diferentes diámetros y estiradas a la llama; para facilitar
esta fase de preparación del ovocito los introducimos en una solución de 80 UI/ml de
hialuronidasa (Sigma, USA) por un lapso no mayor a los 30 a 40 segundos, seguido de
un lavado extra en medio de cultivo que nos permita identificar y valorar su estado de
madurez nuclear ya que serán microinyectados sólo aquellos en estadio de metafase II o sea que han conseguido la extrusión de su primer corpúsculo polar. (Figura 2) En
ocasiones es posible cultivar in vitro los ovocitos inmaduros (estadios de vesícula germinal y metafase I) hasta que ocurra el fenómeno de la extrusión para hacer posible
su microinyección y aumentar las posibilidades de disponer un mayor número de
embriones viables; d) cultivo de los ovocitos en medio IVF por 4 a 5 horas en una incubadora con temperatura controlada y 5% de concentración de CO2 (Forma
Scientific Modelo 3130, USA).
FIGURA 2.- Ovocito en metafase II
Procesamiento del Semen.- Inmediatamente se realiza la identificación y clasificación
de los ovocitos se solicita al esposo o cónyuge la obtención de la muestra de semen por
masturbación. Los espermatozoides eyaculados son procesados para la ICSI utilizando
diferentes técnicas. En nuestro laboratorio del CEMEFES empleamos la técnica de preparación espermática con gradientes de concentración con Isolate (Irvine Scientific,
USA) centrifugando la muestra a 200-300 g durante 20 minutos; se resuspende el conglomerado o pellet y se lo lava en 5ml de medio Menezo B2 (CCD International,
Francia) por un lapso de 5 minutos y, en el interior de la incubadora, se deja migrar a los espermatozoides hasta inmediatamente antes de su utilización.
8 Las muestras con severa oligo-astenozoospermia deben ser manipuladas con el máximo cuidado y si es posible, en estos casos, se debe solicitar una segunda muestra que nos
asegure la disponibilidad de espermatozoides móviles. Por otro lado, la preparación de
la muestra seminal presenta ciertas variaciones según se originen del eyaculado total,
eyaculado fraccionado, eyaculación retrógrada, aspiración epididimaria y aspiración o
biopsia del testículo. En todos los casos de recuperación quirúrgica se procurará
criopreservar los espermatozoides sobrantes.
Preparación de la placa para la ICSI.- Usando como base una placa de Petri de
plástico (Falcon,USA) se ubican en la periferia 5 gotas de 5 µl de medio Gamete
conteniendo un ovocito en cada una de ellas y una gota central de 5 µl de
polivinilpirrolidona (PVP, Irvine Scientific, USA) al 10% y se añade 1 µl de la solución
final del semen preparado. Todas las microgotas se cubren cuidadosamente con aceite
mineral con objeto de impedir variaciones en la temperatura y el pH de los medios
utilizados.
Técnica o Proceso de la Microinyección.- Nuestro laboratorio está equipado con un
microscopio invertido Olympus modelo IX70 (Olympus Japón) provisto de un sistema
de modulación óptica Hoffman (Modulation Optics Inc, USA), de una platina térmica
especial y complementado con un equipo de micromanipulación (Narishige, Japón) que
consta de un micromanipulador electrónico y 2 micromanipuladores hidráulicos
mecánicos. Se complementa con una video cámara y monitor (Sony, Japón). (Figura 3)
Los sistemas de sujeción e inyección se instalan a través de tubos plásticos flexibles con
aceite suficiente, purgado adecuadamente y que incluye el uso de jeringuillas de vidrio
herméticamente cerradas para permitir el control absoluto de los micromovimientos. Es
importante mantener la temperatura a nivel del microscopio a través del control de la
platina térmica.
FIGURA 3.- Microscopio invertido Olympus con sus accesorios para micromanipulación
La temperatura ambiental es de vital importancia para la sobrevida de los ovocitos y no
deben ser expuestos, bajo ningún concepto, a cambios térmicos ni aun por breves
períodos durante la micromanipulación. Además, las microherramientas son muy
sensibles a la mínima vibración ambiental, de tal modo que el microscopio y sus
accesorios deben instalarse sobre una base sólida y balanceada.
Las pipetas, especialmente la de microinyección, son factor fundamental para conseguir
una perfección técnica y por ende altas tasas de fertilización y bajos porcientos de
9
degeneración ovocitaria(54). Las pipetas son fabricadas a partir de capilares de
borosilicato y algunas clínicas las diseñan y elaboran para su uso particular luego de un
proceso difícil y prolongado. En la actualidad existen varias compañías fabricantes de
micropipetas, de calidad comprobada, cuyo uso facilita el trabajo y ahorra tiempo y
esfuerzo.
La pipeta de sujeción o “holding” tiene su extremo distal romo con un diámetro externo
de 60 µ e interno de 20 µ y, va conectada al sistema microinyector con un paso de rosca
mediante el cual se ejerce presión negativa que fija al ovocito y lo mantiene en posición
correcta para la microinyección. La pipeta de inyección posee un diámetro externo de 7
µ e interno de 5 µ con un extremo distal biselado en extensión adecuada y termina en
un afilado aguijón que permite ingresar fácilmente al ovocito. En el CEMEFES ambos
tipos de pipetas son adquiridas en la casa Humagen (USA) y utilizamos aquellas
provistas con una curvatura distal de 35 grados que nos facilita el ajuste en un plano
paralelo a la placa de microinyección. Para la colocación de las pipetas y su alineación
paralela usamos sucesivamente las magnificaciones 10x, 20x y 40x y para la precisa
maniobrabilidad de las mismas recurrimos a 400x.
El extremo de la pipeta de inyección se introduce delicadamente en una gota de PVP y,
bajo presión neutra controlada, se aspira un volumen mínimo de la solución que servirá
para enlentecer los movimientos del espermatozoide vivo seleccionado basado en su
morfología. El tipo de motilidad es secundario mientras esté provisto de movimientos
“twitching” como signo de vitalidad y sin tomar en consideración otros parámetros
espermáticos(38). El espermatozoide será en lo posible totalmente inmovilizado mediante
varios toques de fricción en la porción de la cola cercana a la pieza intermedia, frotando
la pipeta contra el fondo del plato. Este paso es de suma importancia para lograr la
activación del ovocito ya que al lesionar ó alterar la membrana plasmática del
espermatozoide, se consigue la liberación de los componentes citosólicos espermáticos
facilitando la descondensación y posterior formación del pronúcleo masculino. Además,
evita que los movimientos flagelares destruyan las estructuras intracelulares del ovocito
de modo que permite la microinyección del espermatozoide entero.
Primero se aspira la porción flagelar del espermatozoide inmovilizado al interior de la
pipeta de inyección y bajo presión y maniobras controladas se consigue que el
espermatozoide avance lentamente hasta colocarse cerca de la punta de la pipeta.
(Figura 4) Deben tomarse en consideración las diferencias en la consistencia del PVP y
medio de cultivo, mientras se realiza esta etapa del procedimiento.
FIGURA 4.- Micromanipulación del espermatozoide en la pipeta de inyección
El ovocito denudado es colocado en su correcta posición aplicando mínima succión en
la pipeta de sujeción; primeramente es rotado lentamente utilizando ambas pipetas hasta
ubicarlo con su corpúsculo polar en posición 6 ó 12 horarias, siguiendo lo recomendado
inicialmente por Palermo y cols. (Figura 5). Posteriores estudios de Blake y cols(55),
10
demostraron que mejores resultados se obtienen cuando el corpúsculo polar es colocado
en posición 8 horarias, concluyendo que el espermatozoide debe estar junto a, pero no
dentro, del eje ovocitario después de la inyección.
FIGURA 5.- Posición del corpúsculo polar a las 6 horarias
Antes de la microinyección la pipeta se alinea a las 3 horarias del ovocito y en este
momento se debe asegurar que el plano ecuatorial del ovocito, la apertura interna de
sujeción y la punta de la pipeta de inyección se encuentran en el mismo punto focal. La
pipeta de inyección, conteniendo al espermatozoide cerca de la punta, es introducida
lentamente al interior del ovocito luego de atravesar la zona pelúcida, mientras que la
membrana plasmática se invagina o extiende conforme progresa la microinyección,
(Figura 6) debiendo tener mucho cuidado de evitar la liberación del espermatozoide en
el surco o canal hecho por la pipeta, fuera del citoplasma.
FIGURA 6.- Microinyección del espermatozoide
La penetración de la membrana plasmática se distingue con facilidad cuando la
invaginada membrana súbitamente cede y se acompaña de una turbulencia cinética del
citoplasma alrededor de la pipeta(56). (Figura 7). Ocasionalmente la membrana
ovocitaria no es perforada aún cuando la punta de la pipeta de inyección alcance la
cercanía de la posición 9 horarias; en esta situación la pipeta puede retirarse suavemente
hasta el centro del ovocito y nuevamente avanzar con movimientos direccionados hacia
arriba y abajo hasta lograr su penetración. La técnica practicada en la mayoría de las
clínicas para constatar la penetración intraovocitaria, consiste en aplicar una mínima
succión que debe ser suspendida tan pronto se observa al citoplasma fluyéndose en la
parte de la pipeta. El espermatozoide es depositado muy lentamente junto al mínimo
volumen de PVP y medio (Figura 8) y luego la pipeta es retirada gradualmente
liberando al ovocito que entonces es lavado y, bajo aceite mineral, colocado en la
incubadora.
11
Fig. 7 Fig. 8
FIGURA 7.- Penetración de la membrana plasmática
FIGURA 8.- Liberación del espermatozoide en el interior del ooplasma
Se han descrito diferentes patrones de comportamiento de la membrana plasmática en el
transcurso de la microinyección(57): ruptura normal, súbita, y dificultosa que, al parecer,
son predictivas de sobrevida y capacidad fertilizante de los ovocitos microinyectados,
así como sobre la incidencia de división partenogenética. En general, la aspiración
citoplásmica es considerada como una parte integral en el procedimiento de la ICSI así
como un paso esencial para conseguir la activación ovocitaria, sin embargo una
aspiración vigorosa se ha reportado como factor crucial en el éxito de la ICSI por un
lado(58) y por otro, existen estudios que mencionan que la aspiración citoplásmica antes
de la microinyección no es esencial para la activación ovocitaria, dada la incrementada
tasa de daño ovular que ocasiona así como no logra mejor la tasa de fertilización(56)
Se ha determinado el tiempo que tardan los ovocitos microinyectados en completar su
meiosis, estableciéndose que después de 16 a 18 horas se observan pronúcleos en el
90% de los casos y el resto se visualizan a diferentes intervalos.(59,60) Se considera que
un ovocito ha fecundado normalmente cuando se observa la aparición de los pronúcleos
masculino y femenino y la extrusión del segundo corpúsculo polar. (Figura 9)
FIGURA 9.- Ovocito fecundado
Entre el 5 a l0% de los ovocitos microinyectados se degeneran a consecuencia del daño
ocasionado por la micropipeta en el interior de las estructuras celulares, o debido a la
introducción de un volumen excesivo de PVP. En aproximadamente el 3% de los
12
ovocitos microinyectados se observa la presencia de 3 pronúcleos (3 PN) probablemente
debido a la no extrusión y posterior descondensación del segundo corpúsculo polar mas
no a poliploidia, ya que tan sólo se microinyecta un espermatozoide por ovocito. Los
ovocitos microinyectados exitosamente presentan tasas de sobrevida y fertilización
similares, independientemente del origen de la muestra espermática: eyaculado,
epidídimo, testículo, e iguales en las muestras en fresco o congelados. La división
mitótica de los ovocitos microinyectados o clivaje se observa a las 24 horas y la
trasferencia de 2 a 4 embriones, según la edad de la paciente y el grado de calidad
embrionaria, se efectúa a las 48 a 72 horas de la aspiración folicular. La fase lútea es
suplementada, en todos los ciclos que se ha usado aGnRH, mediante la administración
de progesterona natural micronizada por vía vaginal, a dosis de 200 mg cada 12 horas
iniciando a las 24 horas de la punción folicular y durante 12 días, momento en el que se
realiza el diagnóstico precoz del embarazo mediante la determinación sérica de la
fracción beta de la HCG.
Gracias al esfuerzo aunado del Grupo Internacional de Trabajo para el Registro de
Reproducción Asistida y la Fuerza de Trabajo de la Sociedad Europea de Reproducción
Humana y Embriología (ESHRE Task Force) para ICSI, disponemos de datos que
evalúan el número de ciclos efectuados y la eficacia de este tipo de TRA en los primeros
años de su aplicación, Tabla I, aunque desafortunadamente estos datos tienen
potenciales limitaciones dada la heterogenicidad de su universo, debido a que existen
diferencias entre los distintos centros participantes con relación a experiencia, técnica,
número de ciclos realizados en cada uno y la amplitud de la información registrada.
TABLA I.- Resultados globales de la ICSI (61,62)
Año No. de ciclos Tasa de embarazo
por aspiración
Tasa de niños en
casa
1993 3.157 23.6 % -
1994 12.586 21.8 % -
1995 47.654 21.7 % 15.9 %
TABLA II.- Resultados de la ICSI con espermatozoides del eyaculado
Referencia No. de ciclos Tasa de fertilización Tasa de embarazo
por transferencia
Palermo y cols (1996) 756 71,5 % 43,9 %
Schoolcrat y cols
(1996) 71 60,7 % 56 %
Vanderzwalmen y cols
(1996) 740 63 % 29 %
Mansour y cols (1996) 650 61 % 30,5 %
Nagy y cols (1995) 965 70 % 30 %
Oehninger y cols
(1995) 102 60,9 % 31,9 %
Cohen y cols (1994) 227 59,6 % 44,1 %
Payne y cols (1994) 100 67% 32 %
El espectacular incremento anual en el número de ciclos realizados significa el enorme interés en todo el mundo por aplicar esta técnica en el campo de la infertilidad
13 masculina. En la Tabla II es posible observar los resultados de la ICSI utilizando
espermatozoides del eyaculado y reportados por diferentes autores entre 1994 a 1996.
La tasa de fertilización varió entre 59,6 % y 71,5% mientras que la tasa de embarazo por
transferencia osciló entre 29% y 56%.
Posteriores reportes en la literatura médica(61,62) demuestran que la tasa de embarazo no
se ve influenciada por la fuente del espermatozoide, que la incidencia de gestación
múltiple se incrementó de 29% a 35% denotando la producción de embriones de buena
calidad y la necesidad de disminuir el número de embriones a transferirse y, por último,
que la incidencia de embarazo ectópico luego de la ICSI fue entre 1,2% a 1,7%,
significativamente menor al 3.6% y 4,3% reportados después de una FIV convencional.
Estadísticas del 2001(72) de la Universidad de Cornell revelan que aplicando la ICSI
exclusivamente en factor masculino severo permite alcanzar tasas de embarazo del 52%,
con tasas de nacidos vivos tan altas como del 37% del ciclo.
También se ha demostrado(63) que en las TRA las tasas de embarazos decrecen
significativamente en mujeres de edad avanzada, siendo muy bajas al sobrepasar los 40
años. Probablemente la disminución de las tasas de implantación en estas mujeres se
relaciona más directamente con una pobre calidad embrionaria, antes que a una
inadecuada receptividad uterina.
En el Centro Médico de Fertilidad y Esterilidad (CEMEFES), institución médica
privada fundada en 1984 y pionera en Ecuador en las TRA(64) el programa de FIV-TE,
se inició en 1991, mientras que el de la ICSI empezó en agosto de 1996 con el soporte y
asesoría tecnológicas del Centro de Reproducción Humana de la Maternidad Sinha
Junqueira de Ribeirao Preto- Brasil. Los datos y resultados obtenidos entre agosto de
1996 a diciembre del 2001 en 95 ciclos estimulados en 86 pacientes con diversos
factores de infertilidad masculina especialmente, femeninos y múltiples o asociados, se
observan en las siguientes tablas:
TABLA III.- Edad de las pacientes
Cabe destacar que casi la mitad de las mujeres: 47.6% eran mayores de 35 años,
debiendo recordar las consideraciones que sobre las posibilidades de embarazo y edad
se han investigado y reportado, tanto en la concepción natural como con reproducción
asistida.
Número de Pacientes Por ciento
25 a 29 años 21 24.4 %
30 a 34 años 24 27.9 %
35 a 39 años 32 37.2 %
Más de 40 años 9 10.4 %
TOTAL 86 100 % 14
TABLA IV.- Indicaciones para la ICSI
En 11 casos que representan el 11.6 % la pareja era portadora de más de un factor de
infertilidad, tanto masculino como femenino.
La recuperación ovocitaria se practicó en 88 ciclos en vista de que 7 de ellos (7.3%)
fueron cancelados debido a inadecuada respuesta de la HOC y el número y estado de
madurez ovocitaria se expresan en la Tabla V:
TABLA V.- Recuperación ovocitaria (88 ciclos)
TABLA VI.- Ovocitos microinyectados (577)
Promedio de ovocitos recuperados por ciclo: 7.9
Promedio de ovocitos microinyectados por ciclo: 6.6
Número de casos Por ciento
Endometriosis 5 5.2 %
Inmunológico 2 2.1 %
Oligo-astenozoospermia 55 57.9 %
Azoospermia Obstructiva 9 9.5 %
Teratozoospermia 2 2.1 %
Eyaculación Retrógrada 2 2.1 %
Falla FIV Previa 6 6.3 %
ESCA 3 3.1 %
Multifactorial 11 11.6 %
TOTAL 95 100 %
Número Por ciento
Ovocitos Maduros 577 83.2%
Ovocitos Inmaduros 116 16.7 %
TOTAL 693 100 %
Número Por ciento
FERTILIZADOS
Clivados
386(347) 66.89 % (89.89 %)
NO FERTILIZADOS
Degenerados
191 (41) 33.10 % (7.10 %) 15
TABLA VII.- Datos acumulativos
A pesar de que estamos conscientes de que nuestro programa de la ICSI ó MEI se
encuentra en plena fase o curva de aprendizaje, dado el relativo escaso número de
pacientes tratadas y que se encuentra en relación directamente proporcional a la
población que manejamos, los resultados obtenidos en esta primera serie reportada
denotan aceptables tasas de fertilización y de embarazos por ciclo aspirado y/o
transferido que, sin duda alguna, se incrementarán conforme se adquiera una mayor
experiencia en la técnica. El porcentaje de ovocitos degenerados luego de la
microinyección: 7,1% se encuentra en niveles similares a los reportados por otros
autores.
El nacimiento en el Ecuador del primer niño vivo producto de un tratamiento con la
ICSI fue reportado en julio de 1997(65).
Dado que la MEI es un procedimiento invasivo, muchos factores que representan un
potencial riesgo debemos siempre tenerlos en cuenta: a) en vista de que no se produce la
selección natural del espermatozoide, puede ser microinyectado uno defectuoso con
probabilidad de ocasionar anomalías genéticas; b) existe la posibilidad de introducir
material genético extraño desconocido como PVP, detritus, aceite, trazas de Percoll,
etc., al interior del citoplasma del ovocito y, c) ocasional daño al ovocito durante la
microinyección relacionado con un posible daño del eje meiótico.
Se ha demostrado el incremento de anomalías cromosómicas en hombres portadores de
un factor de esterilidad severo(66,67) debido al uso de espermatozoides con aneuploidia
que puede transmitirse a los descendientes, especialmente de aneuploidia de los
cromosomas sexuales, o a la microinyección de espermatozoides testiculares en casos
de azoospermia no obstructiva. También se ha documentado(68) el alto riesgo de
aumento en la frecuencia de fibrosis quística luego de la MEI de espermatozoides
epididimarios o testiculares de hombres con ausencia congénita bilateral de los vasos
deferentes, así como el significativo número de hombres azoospérmicos portadores de
defectos de translocación que afecta especialmente al brazo largo del cromosoma Y(69).
En relación a la seguridad de la MEI comparada con los datos obtenidos por la FIV, un
ultimo reporte del 2002 de la Universidad Libre de Bruselas-Bélgica(70) que incluyen
Ciclos Estimulados 95 20.0 %
Ciclos Aspirados 88 21.6 %
Ciclos Transferidos 79 24.0 %
Embriones Transferido por
paciente
3.3
Embarazos 19
Vivos 11
En curso 3
Abortos 4
Ectópico 1
16
2889 niños nacidos luego de la microinyección entre 1991-1999 y 2995 luego del FIV
entre 1983-1999 cuyos seguimientos incluye consejo genético, eventual diagnostico
prenatal y exploración física luego de 2, 12 y 24 meses de nacimiento, concluye que las
malformaciones mayores, definidas como aquellas que causan impedimento funcional o
que requieren de corrección quirúrgica, son del orden del 3.4 % en la MEI y del 3.8 %
en la FIV (P = 0.538) y que la tasa total de malformaciones tomando en consideración
en los dos grupos los óbitos fetales, interrupciones del embarazos y recién nacidos, fue
de 4.2 % para la microinyección y de 4.6% para la FIV (P = 0.482).
Por lo contrario, el grupo de la Universidad de Western Australia en Perth(71) en una
muy reciente publicación del 2002 que analiza tres registros australianos de niños
nacidos entre 1993 a 1997 con malformaciones o defectos mayores luego de la
concepción asistida y controlados hasta el primer año de edad en comparación a niños
concebidos naturalmente, reporta una incidencia de anomalías del 8.6 % en 301 niños
productos de la MEI y del 9% de la FIV, en relación al 4.2 % de 4000 nacimientos
naturales en el mismo periodo de tiempo, concluyendo que existe el doble de alto riesgo
de malformaciones mayores al nacimiento en casos de la MEI o la FIV.
Los riesgos de la MEI incluyen los riesgos generales descritos para la FIV así como
riesgos relacionados con el procedimiento de micromanipulación por si mismo(72). Por
lo tanto, debemos considerar la incidencia de síndrome de hiperestimulación ovárica
severa con todas sus manifestaciones clínicas; las complicaciones, aunque raras, de la
recuperación ovocitaria por aspiración transvaginal y/o laparoscópica; las gestaciones
multifetales asociadas a una mayor incidencia de preeclampsia, placenta previa,
abruptio placenta, ruptura prematura de membranas, hemorragia postparto, marcada
prematurez que incluye parálisis cerebral y hemorragia intracraneal con retardo mental
y ceguera; incremento de la tasa de aborto espontáneo ( 10 – 16 %), etc.
CONCLUSIONES
Los avances en el campo de la reproducción asistida y la micromanipulación de
gametos humanos han sido verdaderamente dramáticos en la ultima década, haciendo
posibles mayores éxitos en el área de la infertilidad por factor masculino severo, siendo
la ICSI o MEI la que ha marcado un verdadero hito en este campo, superando con
creces a otras técnicas como la PZD y la SUZI.
Utilizando la técnica ya sea con espermatozoides eyaculados, epididimarios y
testiculares, se logran satisfactorias tasas de fertilización y embarazo en los distintos
factores de infertilidad señalados en este artículo, resultando aquellos pacientes con
azoospermia no-obstructiva debido a un arresto del espermatogénesis y otro
impedimento en la maduración de las células germinales, las que se benefician con la
extracción directa de espermatozoides del parénquima testicular a través de
microbiopsias e inclusive, en ausencia de éstos, es posible la microinyección de
espermátides redondas y espermatocitos secundarios.
En los momentos actuales prácticamente no quedaría ningún tipo de factor masculino
capaz de ser solucionado con esta técnica, a excepción de aquellos casos con un arresto
total de la espermatogénesis y a quienes hasta pocos años atrás sólo era posible
ofrecerles la donación o la inseminación con donante.
17
A pesar de tratarse de una técnica que, en comparación con la FIV convencional, es más
costosa, consume mayor tiempo, requiere de equipamiento adicional, habilidades extras
y es totalmente invasiva, su práctica se ha difundido en todos los centros especializados
gracias a sus bondades y resultados satisfactorios. Sin embargo, son controversiales e
inconsistentes los datos estadísticos en relación a su seguridad y la incidencia de
malformaciones congénitas y presencia de anomalías cromosómicas sexuales y
aberraciones, sobretodo en la descendencia de hombres con severo factor espermático
de infertilidad, en comparación con la población general.
Por ultimo, considerando los potenciales beneficios y riesgos de la práctica de la MEI,
vale la pena manifestar ciertas recomendaciones a las parejas que van a someterse al
procedimiento: 1) tamizaje genético a los futuros o potenciales padres basado en la
historia clínica y exploración física; 2) parámetros seminales mínimos y tamizaje
genético para defectos severos; 3) uso conservativo de la MEI e incluso valorar su
práctica únicamente en indicaciones relacionadas con factor masculino severo; 4) evitar
los embarazos múltiples limitando el numero de embriones transferidos (3 embriones en
mujeres menores de 35 años). A pesar de existir regulaciones al respecto en países como
Inglaterra, Australia y Francia, en otros países y en muchas clínicas, sobretodo
latinoamericanas existe una significativa presión por parte de la pareja para transferir más de 3 embriones, debido a su marcada desesperación por concebir; 5) firma y
documentos de identidad de la pareja en un consentimiento informativo escrito;
6) seguimiento a largo plazo a los niños nacidos por técnicas micromanipulación y, 7)
aumentar las investigaciones.
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)