COVID-19 REDLARA: LIvros (Reprodução Assistida)
Análise do Sêmen para Reprodução Assistida
A análise do sêmen constitui-se na pedra básica da avaliação do fator masculino em reprodução assistida. O espermograma convencional inclui o estudo de aspectos particulares da função espermática como a concentração, motilidade e morfologia, assim como, na quantificação e identificação de células não espermáticas, anticorpos antiespermatozóides e testes de penetração. A amostra de sêmen deve ser coletada através de masturbação, em frasco estéril, de plástico ou vidro, após abstinência sexual mínima de 48 horas. A amostra será colhida em sala próxima ao laboratório de análise. Não sendo possível, a coleta poderá ser realizada em outro local, porém o tempo de entrega do material para estudo, não deve ser superior a 30 minutos. Assim como, a temperatura ideal para transportar o material estaria entre 20º C e 37º C. Rotineiramente, a amostra será identificada com o nome do paciente, data e horário da coleta. Por outro lado, o paciente deve relatar qualquer perda de material durante o ato de coleta, ou quadro febril recente (últimos 3 meses). Uma avaliação ideal da função espermática baseia-se na análise de três amostras de sêmen.
Análise Macroscópica
Aparência, cor e liquefação
A amostra de sêmen normal possui cor branca opalescente, sendo homogênea e se liquefaz `a temperatura ambiente em menos de 60 minutos. A amostra pode conter grânulos gelatinosos, os quais não se liquefazem, e neste caso, será considerada heterogênea. Um aumento da viscosidade ou consistência poderia interferir no processo de determinação da concentração dos espermatozóides. A amostra que possui uma coloração marrom indicaria a presença de glóbulos vermelhos. Em geral, as amostras com filamentos de muco que comumente acarretam uma incompleta liquefação, devem ser submetidas a um processo mecânico de liquefação pela passagem através de uma agulha de 19 G ou por processo químico pelo uso da bromelina (concentração de 1g por litro).
pH.
Uma vez liquefeita a amostra de sêmen, coloca-se uma aliquota sobre o papel de pH (faixa de pH 6.1 a 10), e observa-se após 30 segundos a cor obtida, que será comparada com a fita de calibração colorimética de pH. O pH é determinado pelas secreções da próstata (ácida) e vesícula seminal (básica). A medida do pH será executada dentro do período de 1 hora da coleta do sêmen, e normalmente, varia entre 7.2 e 7.8. Obrigatoriamente, as amostras com pH superior a 7.8 devem ser avaliadas quanto a presença de infecção. Em caso de pH menor que 6.5, pode se levantar a suspeita de agenesia, ou oclusão das vesículas seminais.
Viscosidade
A viscosidade ou consistência da amostra liquefeita pode ser estimada por gentil aspiração do sêmen em pipetas de 5 ml, seguida de fácil gotejamento. Dessa forma, a amostra será classificada como normal quando gotas são formadas. No caso de viscosidade anormal verifica-se no processo de gotejamento a formação de um filamento de mais de 2 cm. O aumento da consistência pode estar relacionado com disfunção prostática por inflamação crônica. A consistência anormal também pode intervir na avaliação de várias características do sêmen, tais como a motilidade, concentração ou determinação de anticorpos antiespermatozóides.
Volume
O volume do ejaculado será medido em cilindros, pipetas ou seringas graduadas, considera-se um volume normal de 2.0 a 5.0 ml. A maior parte do volume é secretada pela vesícula seminal, sendo que a próstata produz entre 0.5 a 1 ml. Um volume acima de 5 ml é suspeito de infecção aguda nas glândulas anexas e quando inferior a 1.5 ml sugestivo de processo inflamatório crônico ou ejaculação retrógada.
Análise Microscópica
A análise microscópica inicial da amostra de sêmen consta do estudo da concentração, motilidade, morfologia, vitalidade, citologia geral, e dos testes de penetração espermática e hiposmótico.
Concentração
Atualmente, a concentração dos espermatozóides é medida através de câmaras de contagem (Makler, Horwell, Neubauer, etc). A câmara de Makler possui uma profundidade de 0.01 mm e uma marcação graduada de 100 quadrados (área total de 1 mm2) cada um com 0.1 mm x 0.1 mm. Assim sendo, o volume compreendido na área de 10 quadrados após a colocação da lamínula é de 0.001 mm3 ou 1 milhão por ml (Figura 3.1). Tal fato, facilita a leitura direta da concentração da amostra de sêmen (milhões por ml) pela simples contagem dos espermatozóides presentes na área de 10 quadrados. Em geral, coloca-se um volume de 10u l de esperma liquefeito no centro da câmara de Makler, adapta-se a lamínula e realiza-se a contagem em microscopia de fase em aumento de 200 vezes (Figura 3.2). Habitualmente, a concentração dos espermatozóides é definida segundo as normas da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1992) : A. Normozoospermia : > 20 x 106 espermatozóides/ml. B. Oligozoospermia: < 20 x 106 espermatozóides/ml. C. Polizoospermia : > 200 x 106 espermatozóides / ml. D. Azoospermia : nenhum espermatozóide no ejaculado.
Motilidade
A motilidade também é realizada em câmara de contagem com microscopia de fase e aumento de 200 vezes . Uma alíquota de sêmen de 10u l deverá ser depositada na câmara, executando-se uma contagem de 100 espermatozóides, o processo será sempre em duplicata. Caso ocorra uma diferença > 10% entre as duas avaliações será executada uma média das 3 observações que será relatada como a motilidade final. A motilidade dos espermatozóides será classificada segundo os padrões da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1992) : Tipo A - espermatozóides móveis com progressão rápida. Tipo B - espermatozóides móveis com progressão lenta. Tipo C - espermatozóides móveis porém sem progressão. Tipo D - espermatozóides imóveis. Finalmente, a amostra de sêmen será considerada normal ou anormal segundo o critério : Normal : >50% do tipo A e B. Anormal : < 50% do tipo A e B.
Morfologia
A morfologia é realizada através da coloração de Shorr e sua avaliação executada após a análise de dois esfregaços de 10u l de sêmen fresco. Um mínimo de 200 espermatozóides são estudados no aumento de 1000 vezes (Figura 3.3). Os espermatozóides são classificados quanto aos aspectos morfológico em dois grupos : A- Normal : A cabeça será levemente ovalada, única, lisa, sem gotas citoplasmáticas e com o acrossoma ocupando cerca de 40% a 70% da cabeça. O diâmetro varia de 3 a 5 um, podendo apresentar até 2 vacúolos citoplasmáticos. A peça intermediária deve medir de 6 a 10 um, alinhar-se com o eixo longitudinal da cabeça, e não apresentar expansões laterais. A cauda será única e desenrolada, com um tamanho de 45 um (Figura 3.4). B - Anormal : 1. Defeitos no acrossoma : a. acrossoma pequeno (< 40%). b. acrossoma grande (> 70%). 2. Defeitos do corpo e peça intermediária : c. peça intermediária larga. d. gota intracitoplasmática. e. peça intermediária separada. 3. Defeitos estruturais : f. piriforme. g. achatado. h. forma de ampulheta. i. superfície irregular. j. mais que dois vacúolos k. achatado no sítio de implantação da cauda. l. não ovalada de um lado m. redonda. 4. Defeitos da cauda : n. inserção. 0. espiralada. p. ângulo > 90 . (Figura 3.5 - A a C) Além disso, deve-se analisar as chamadas formas imaturas que são definidas como células esféricas que apresentam diâmetro nuclear entre 4 e 9 um e ausência de cauda. A morfologia espermática normal segundo a Organização Mundial de Saúde (WHO, 1992) é definida pela presença de formas normais em 30% ou mais dos espermatozóides examinados. Todavia, usando-se os critérios de Kruger (1986) baseado na avaliação morfológica e subsequente performance em fertilização "in vitro" (FIV), define-se como morfologicamente normais os pacientes que mostraram formas normais em >14% dos espermatozóides analisados. A coloração de Shorr é usada de rotina para avaliação da morfologia espermática. Em geral dois esfregaços de sêmen são preparados e após sua secagem na temperatura ambiente, realiza-se a passagem nos seguintes reagentes : 1. Álcool 70º por 15 minutos; 2.Água corrente; 3. Corante de hematoxilina por 45 segundos; 4. Água corrente; 5. Álcool 90º ; 6. Corante de Shorr por 5 minutos; 7. Álcool 95º (3 passagens sucessivas); 8. Álcool absoluto (3 passagens sucessivas); 9. Alcool - xilol (1:1); 10. Xilol (2 passagens sucessivas).
Vitalidade
A vitalidade será avaliada através da combinação dos corantes eosina e nigrosina em esfregaço de sêmen fresco. Esta técnica baseia-se no fato de que as células mortas apresentam membranas lesadas que permitem a penetração de corantes. Uma contagem de 100 espermatozóides deverá ser realizada em microscópio comum com aumento de 1000 vezes de forma a diferenciar as células vivas (não coradas) das mortas (coradas). Inicialmente, pipeta-se num tubo o volume de 100 ul de sêmen, adicionando-se duas gotas de eosina, e homogeiniza-se a solução por 30 segundos. Em seguida, adiciona-se 4 gotas de nigrosina, homogeiniza-se por 45 segundos e executa-se um esfregaço que após a secagem é submetido a uma análise microscópica em aumento de 1000 vezes. O resultado é apresentado na porcentagem total dos espermatozóides vivos (não se coram). Lembrar que os espermatozóides mortos coram-se de vermelho. As substâncias usadas para a determinação da vitalidade são as seguintes : 1. Eosina amarela (Merck) na concentração de 3% em solução fisiológica. Estocar na temperatura ambiente; 2. Nigrosina hidrossolúvel (Merck) na concentração de 8% em solução fisiológica. Filtrar e estocar na temperatura ambiente.
Teste hiposmótico
A finalidade deste teste é avaliar a integridade funcional da membrana celular dos espermatozóides quando estes são colocados em uma solução hiposmótica. Inicialmente, ocorre uma entrada de líquido para o interior da célula com a finalidade de se estabelecer o equilíbrio osmótico. Como resposta a esse fato, a membrana dos espermatozóides incha-se formando espaços líquidos na cauda dos espermatozóides. A presença de inchaço indicará que o transporte de fluidos através da membrana ocorreu normalmente, sendo esta, considerada íntegra do ponto de vista funcional. Assim sendo, uma solução de 150 mOsm/l é obtida com um meio de cultura (Menezo B2, GPM, IVF-50, etc) diluido em água destilada (1/1). Em seguida, coloca-se 1.0 ml da solução hiposmótica num tubo, e incuba-se na temperatura de 37º C por 10 minutos. O sêmen liquefeito num volume de 100 ul é depositado no tubo, e o conjunto incubado por 30 minutos na temperatura de 37º C. Finalmente, retira-se uma alíquota de 10 ul da suspensão de esperma, e observa-se um mínimo de 200 espermatozóides em microscópio de fase com aumento de 200 vezes. O cálculo da porcentagem de espermatozóides que apresentam inchaço na cauda é determinado pela relação : THO (%) = Número de espermatozóides com inchaço x 100/Total de espermatozóides contados A amostra de sêmen será considerada normal quando mais que 60% dos espermatozóides apresentarem inchaço de cauda (Figura 3.6). O significado do teste hiposmótico na previsão da fertilidade masculina ainda é controvertido. Alguns grupos relatam uma pobre correlação entre o teste hiposmótico e os resultados posteriores em FIV (Barrat e cols., 1989, Jager e cols., 1991). Entretanto, Uchida e cols. (1992) mostraram que o teste hiposmótico é efetivo na avaliação da capacidade de fertilização dos espermatozóides quando é usada a técnica de sedimentação-migração ("swim-up") como método de capacitação dos espermatozóides. Em 1988, Liu e cols. selecionaram espermatozóides móveis e utilizaram uma análise de regressão, não achando correlação entre os escores do teste hiposmótico no sêmen (ou após "swim-up") e a fertilização de oócitos "in vitro". Franco Jr. e cols. (1995a) apesar de empregarem o método de "swim-up" verificaram que o teste hiposmótico não foi eficaz na identificação de uma população masculina com posterior falha total de fertilização ou em diferenciar aquela com taxas de clivagem 50% daquela com valores < 50%. Além disso, coeficiente de correlação "pi" entre os valores do teste hiposmótico e a taxa de clivagem embrionária foi fraco ( = 0.19).
Exame citológico
O sêmen também possui outras células além dos espermatozóides, tais como as células epiteliais poligonais do trato uretral, células espermatogênicas, leucócitos e hemácias. A concentração destas células na amostra, pode ser estimada na câmara de Makler, por ocasião da contagem dos espermatozóides. Nos casos em que a amostra de sêmen apresentar uma concentração de leucócitos superior a 1 x 106 por ml, deve-se avaliar a possibilidade de o paciente possuir qualquer infecção nas glândulas sexuais acessórias. Em seguida, afastar a presença de protozoários (Trichomonas vaginalis) ou fungos (Candida albicans).
Teste de penetração espermática
O teste de penetração espermática tem como finalidade medir a habilidade dos espermatozóides penetrarem no muco cervical, ou qualquer fluido substitutivo, como o muco bovino, clara de ovo, etc. Em virtude da dificuldade da obtenção rotineira do muco cervical humano, executa-se em nosso laboratório o chamado teste de penetração na clara do ovo. Inicialmente, um volume da clara do ovo é aspirado através de uma seringa e avaliado quanto ao pH, ajustando-se o mesmo entre 7.0 e 7.5 através de uma solução tampão com Hepes (0.119 g/10ml, Sigma H-6147). O teste de penetração na clara do ovo é realizado em capilar plano (Microslides, Vitro Dynamics Inc., USA), preenchido com clara de ovo, vedado na extremidade superior e colocado verticalmente em contato com sêmen liquefeito (200 ul). Em seguida, incuba-se na temperatura de 37º C por 90 minutos. A penetração dos espermatozóides é avaliada por um sistema graduado em milímetros utilizando-se um microscópio de contraste de fase com um aumento de 400 vezes. O teste de penetração é considerado normal quando o espermatozóide vanguardeiro atingiu ou ultrapassou, o valor de 30mm (Figura 3.7). Franco Jr. e cols. (1995b) testaram a hipótese de que o teste de penetração dos espermatozóides na clara do ovo (TPECO) poderia identificar uma população masculina com maior probabilidade de fertilizar oócitos em cultura. O TPECO foi executado num total de 70 amostras de esperma durante a investigação prévia ao programa de FIV; posteriormente os 70 pacientes e suas esposas participaram do programa de FIV. O nível médio de clivagem embrionária foi de 68 ± 33.6%. A sensibilidade do TPECO foi de 0.62, a especificidade de 0.85, o valor preditivo do teste anormal de 0.35, e o valor preditivo do teste normal de 0.95 quando usado para avaliar a habilidade da população masculina formar embriões. A eficácia (0.73) foi próxima da obtida com a análise morfológica dos espermatozóides (0.79). Por outro lado, quando diferentes parâmetros do sêmen (concentração, morfologia e motilidade) e o TPECO foram comparados em termos de poder identificar populações com >50% ou <50% de níveis de clivagem embrionária, apenas a morfologia e o TPECO mostraram significativa correlação com a taxa posterior de clivagem embrionária. Em conclusão, o TPECO pode identificar uma população masculina com maior probabilidade de fertilizar oócitos em cultura.
Teste do hamster
Desde o trabalho pioneiro de Yanagimachi (1976) que demonstrou a possibilidade da penetração dos espermatozóides humanos nos oócitos de hamster, diversos laboratórios têm usado esse método na investigação do fator masculino em infertilidade. Essa técnica avalia a capacidade de penetração dos espermatozóides "in vitro" sem o uso de oócitos humanos. Entretanto, uma análise da literatura identifica uma dificuldade no estabelecimento das condições padrões para esse teste (Rogers e cols., 1979; Cohen e cols., 1982). Em linhas gerais. o método propicia o conhecimento de inúmeras variáveis que participam do processo de interação dos gametas "in vitro", apesar das ressalvas quanto a complexidade e elevado custo na sua instalação e manutenção. Em síntese, o sêmen é colhido após masturbação sendo submetido ao processo de capacitação laboratorial. Os espermatozóides ativados são incubados na temperatura de 37º C com a finalidade de completarem o tempo ideal de capacitação (teste curto : 3 a 4 horas; teste longo : 18 a 20 horas). Em seguida, selecionam-se fêmeas adultas de hamster que são submetidas ao método de estimulação ovariana com gonadotrofinas para a obtenção de uma superovulação. O "cumulus oophorus" é retirado com a abertura dos ovidutos e submetidos à ação da hialuronidase (0.1%). Tal fato permite a liberação de inúmeros oócitos. Numa próxima etapa, os oócitos são colocados sob a ação da tripsina (0.1%) e perdem sua zona pelúcida, fator limitante para a fertilização interespécie. Habitualmente, entre 25 e 30 oócitos são incubados com uma concentração de 2 a 10 milhões de espermatozóides móveis por ml, durante o período de duas horas (teste curto). Após esse período, o fenômeno de fertilização é determinado pela presença de espermatozóides com cabeça aumentada (inchaço cefálico) dentro do oócito (Franco Jr. e cols., 1988). Com respeito aos critérios de interpretação do teste do hamster numa população masculina fértil, ainda permanecem dúvidas pois, enquanto Rogers e cols. (1979) consideram como normal o paciente que apresenta índices de fertilização iguais ou superiores a 15%, Hall (1981) e Werlin e cols. (1985) referem limite inferior de normalidade o valor de 20%, e validam o teste com um mínimo de três exames repetidos com intervalo de tempo apropriado. A especificidade do teste do hamster é relativamente boa, entretanto, sua sensibilidade na seleção das populações inférteis não é das melhores, ou seja, 24.2%. O critério rigoroso na definição do valor anormal do teste de hamster é fundamental, pois situações clínicas reversíveis, como a piospermia no líquido seminal, podem alterar de forma passageira os índices de fertilização dos oócitos (Berger e cols., 1982). Outro aspecto de real interesse, seria a determinação do verdadeiro papel do teste do hamster na previsão da capacidade de fertilização dos espermatozóides humanos quando colocados em contacto com os oócitos das esposas. Hall e cols., (1983) analisando uma população masculina que participava de um programa de FIV, observou que os maridos com índices de fertilização superiores a 14% fertilizaram, no mínimo, um oócito. Ao contrário, aqueles com índices inferiores a 14% falharam em fertilizar os óocitos em 80% das vezes. Foreman e cols. (1984) verificaram que nove homens de um total de quinze que falharam em fertilizar os oócitos de sua esposa "in vitro", conseguiram fertilizar os oócitos do hamster. Enfim, o valor clínico do teste do hamster na identificação do homem infértil, tanto na previsão da gravidez "in vitro" quanto "in vivo" ainda não está bem estabelecido. Além disso, é provável que outros testes mais simples de previsão do poder dos espermatozóides fertilizar oócitos "in vitro" (Franco Jr. e cols., 1993) possam apresentar sensibilidade e especificidade idêntica, ou superior, ao teste do hamster. Do ponto de vista clínico, a introdução da injeção intracitoplasmática dos espermatozóides (ICSI) causou uma diminuição geral no uso de testes de previsão da fertilização de oócitos em cultura como rotina na avaliação prévia ao emprego de técnicas de reprodução assistida.
Referências Bibliográfica
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)