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Fertilização Assistida
A micromanipulação de gametas e embriões não é um conceito novo, várias técnicas há quase um século têm sido empregadas em invertebrados e animais inferiores. Em 1914, Kite realizou a primeira tentativa de injeção de espermatozóides no citoplasma de óocitos de peixe estrela. Em 1962, Hiramoto microinjetou espermatozóides de ouriço do mar em óocitos homólogos, desde então vários procedimentos de micromanipulação têm sido praticados com gametas e embriões de mamíferos, como as dissecções da zona pelúcida (ZP), inserções de espermatozóides em vários compartimentos do oócito, remoção e transplante de pronúcleos e blastômeros. Em 1976, Uehara e Yanagimachi demonstraram que oócitos de hamster não fertilizados injetados com núcleo de espermatozóides isolados eram capazes de se ativar e formar pronúcleo feminino e masculino. A injeção de espermatozóides em oócitos de mamíferos foi repetida por outros pesquisadores (Uehara e Yanagimachi, 1977; Thandani, 1980; Markert, 1983; Lanzendorf e cols., 1988a) os quais demonstraram que este procedimento não prejudicava a capacidade funcional e o desenvolvimento dos oócitos. Com a introdução das técnicas de fertilização "in vitro" (FIV) e cultivo de embriões humanos, aumentou o interesse por estes procedimentos e o seu uso tornou-se rotineiro nos centros de infertilidade. Até hoje, três técnicas foram utilizadas para melhorar a habilidade de fertilização dos espermatozóides : I. Abertura da zona pelúcida. II. Inserção de espermatozóides no espaço perivitelínico. III. Inserção de espermatozóides no ooplasma.
Abertura da zona pelúcida
A abertura da zona pelúcida (ZP) pode ser realizada por meio enzimático (tripsina), químico (ácido de Tyrode) ou mecânico. Na primeira tentativa de abertura da ZP os pesquisadores injetaram um pequeno volume de solução ácida de Tyrode numa área da ZP de camundongo. Em seguida, com a abertura da ZP, verificaram que ocorria um aumento nas taxas de fertilização, com a subseqüente inseminação dos oócitos com concentração de espermatozóides normal ou reduzida (Gordon e Talansky, 1986). Em 1988, Gordon e cols. trataram 10 casais com falhas de fertilização em ciclos anteriores de FIV, verificando que fertilizaram 10 de 31 oócitos (32%), porém 52% desses apresentaram poliespermia. Em seguida, três transferências embrionárias foram executadas, contudo nenhuma gravidez foi obtida. Malter e Cohen (1989a) desenvolveram um método pelo qual a abertura da ZP é feita mecanicamente pela dissecção com uma microagulha. Neste método chamado de dissecção parcial da zona pelúcida (PZD), o oócito é desnudado com solução de hialuronidase e colocado em solução de sucrose para aumentar o espaço perivitelínico, facilitando a dissecção da ZP, sem causar danos no ooplasma. Em seguida, o oócito é fixado por uma micropipeta denominada "holding" e uma microagulha é inserida na ZP, esta atravessa o espaço perivitelínico e alcança o lado oposto da ZP, sem perfurar o oolema. Após a inserção, o oócito é desligado da "holding" e a microagulha que contém o oócito é posicionada paralelamente `a "holding", de forma a encostá-la na ZP. Um movimento horizontal da microagulha é realizado até que o oócito se desligue desta, confirmando a dissecção (Figura 10.1). Após este procedimento o oócito é retirado da solução de sucrose, lavado com meio de cultura e transferido para o meio de inseminação. Malter e cols. (1989) trabalhando com oócitos frescos obtiveram aumento das taxas de fertilização e clivagem (79% e 68%) em relação ao controle (53% e 33%), sem aumentar a incidência de polispermia. Cohen e cols. (1988) relataram a primeira gestação em humanos usando micromanipulação (PZD). O método de PZD foi empregado em pacientes que apresentaram fertilização baixa ou ausente nos procedimentos convencionais de FIV e naqueles com alterações nos parâmetros espermáticos. Em 1992, Vanderzwalmen e cols. avaliaram 34 casais e demonstraram um aumento significativo nas taxas de fertilização dos oócitos micromanipulados em relação ao controle (14.6% versus 5.5%), conseguindo gestações clínicas por transferência embrionária em 15% dos casos. Em 1993, Terriou e cols. relataram aumento na taxa de fertilização de 4.5% para 16.1%, sugerindo essa técnica para os casos de falha total de fertilização em FIV anteriores. Nos pacientes com oligoastenoteratozoospermia, uma concentração dos espermatozóides aumentada poderia elevar as taxas de fertilização (Oehninger e cols., 1988; Franken e cols., 1990), todavia essa conduta poderia aumentar a polispermia devido a falta de controle do número de espermatozóides que entram no espaço perivitelínico, desde que o bloqueio da polispermia é efetuado ao nível da ZP e o tamanho da abertura na ZP do oócito poderia influenciar esse fato. Talansky e Gordon (1988) e Malter e Cohen (1989b) observaram em camundongos que, dependendo do tamanho da abertura da ZP, o processo de "hatching" pode apresentar anormalidades, como uma expulsão antecipada dos blastômeros (efeito deletério para o embrião). Atualmente, o procedimento de abertura da zona pelúcida não é usado com finalidade de aumentar as taxas de fertilização dos oócitos "in vitro", especialmente após o desenvolvimento da metodologia da injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI).
Inserção de espermatozóides no espaço perivitelínico (SUZI)
Um segundo método utilizado para fertilização de gametas humanos é a inserção subzonal de espermatozóides (SUZI) o qual envolve a injeção de um ou mais espermatozóides no espaço perivitelínico (Ng e cols., 1988). Nesta técnica, a ZP não é apenas aberta, mas ultrapassada fisicamente e funcionalmente. Os espermatozóides são sugados para dentro de uma micropipeta, esta é colocada em contacto com a ZP do oócito e pressionada sob a ZP, até que penetre no espaço perivitelínico. Os espermatozóides são depositados no espaço perivitelínico com uma quantidade mínima de meio de cultura e a micropipeta é retirada (Figura 10.2). Em geral, os espermatozóides capacitados e com reação acrossômica são capazes de fundir com o ooplasma. Laws-King e cols. (1987) obtiveram dois pronúcleos em 5 de 7 oócitos microinjetados com espermatozóides pré-tratados. Lassale e cols. (1987) realizando experimentos similares demonstraram uma diminuição na taxa de fertilização dos oócitos humanos e de hamster, quando menos que 5 espermatozóides não tratados foram injetados no espaço perivitelínico. Posteriormente, demonstrou-se que a indução acrossômica com ionóforo de cálcio antes de proceder o SUZI, aumentou significativamente as taxas de fertilização em oócitos de hamster (Lassale e Testar, 1988). Em adição, a injeção de vários espermatozóides aumenta o risco de polispermia. Cohen e cols. (1991a) trabalhando com uma população de homens inférteis demonstraram um aumento significativo de polispermia quando mais que dois espermatozóides móveis eram inseridos, obtendo-se 100% de polispermia quando se inseriram mais que 8 espermatozóides. Imoedemhe e cols. (1993) demonstraram taxas baixas de polispermia quando mais que 2 espermatozóides são inseridos, argumentando a existência de algum bloqueio ao nível do ooplasma. A técnica de SUZI tem sido empregada em casos que envolve a presença de espermatozóides imóveis (Bongso e cols., 1989), oligoastenozoospermia (Fishel e cols., 1990; Ng e cols., 1991), aspiração do epidídimo, teratozoospermia (Cohen e cols., 1991b), espermatozóides criopreservados (Levron e cols., 1992) e falha inexplicada de fertilização (Wolf e cols., 1992). Em 1988, Ng e cols. descreveram a primeira gravidez obtida por este método, desde então outros autores tem conseguido sucesso com essa técnica, com variações nas taxas de fertilização (Tabela 10.1) e de gravidez (Tabela 10.2) mas que sempre foram inferiores as obtidas atualmente com ICSI
Tabela 10.1 - Resultados de fertilização após o procedimento de SUZI
Autores Número
oócitos Número espermatozóides
injetados Porcentagem
fertilização normal
Bassil e cols.1994 2554 1 a 15 19
Fishel e cols.1992 1003 3 a 4 16
Imoedemhe e cols. 1993 276 4 a 5 26
Kinis e cols.1994 73 4 a 5 18
Krzminska e cols. 1991 232 5 a 25 21.6
Palermo e cols. 1992 464 3 21
Wiker e cols.1993 153 7 22.9
Tabela 10.2 - Resultados de gravidez após o procedimento de SUZI
Autores Ciclos SUZI Número transferências Porcentagem gravidez clínica
Catt e cols.1994 332 200 21
Fishel e cols.1992 225 82 15
Gianaroli e cols.1991 60 39 5
Imoedemhe e cols.1993 39 26 21
Ng e cols.1991 116 58 8.6
Palermo e cols.1992 44 34 20.6
Wittemer e cols.1994 91 63 15.4
Wiker e cols.1993 18 15 26.7
Injeção intracitoplasmática
de espermatozóides (ICSI)
Aspectos históricos
Em 1988b, Lanzendorf e cols. descrevem pela primeira vez a ICSI na espécie humana, com o relato da obtenção de pronúcleos após a microinjeção de 20 oócitos (taxa de fertilização de 35%). Inicialmente, esses oócitos apresentaram vesícula germinativa, sendo apenas submetidos a ICSI quando liberaram o primeiro corpúsculo polar. Nesse trabalho, não houve transferência uterina dos pronúcleos formados. Em 1991, Ng e cols. analisaram o emprego da ICSI no tratamento de casos com oligoastenozoospermia severa. Um total de 38 oócitos em metáfase II foram microinseminados obtendo-se uma taxa de fertilização de 10.5%, com lesão dos oócitos em 31.6% das vezes. Os pronúcleos obtidos foram transferidos para a trompa porém não ocorreram gestações. Naquela ocasião, o autor desaconselhou o uso da ICSI como terapia do fator masculino alterado de forma severa. Em 1992, Palermo e cols. descreveram o emprego da ICSI em 47 oócitos pré-ovulatórios (metáfase II), verificando que 38 permaneceram intactos após a microinjeção, fertilizaram 31 (taxa de fertilização de 66%) e foram transferidos para o útero 15 embriões. Um total de 4 gestações foram obtidas após 8 ciclos de tratamento (duas gestações únicas, uma gemelar, e um aborto pré-clínico). Em 1993, Palermo e cols. aplicaram ICSI em 716 oócitos pré-ovulatórios obtendo uma taxa de fertilização de 44% numa população com fator masculino alterado.
Aplicação da ICSI
A indicação da ICSI no Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira não se limita apenas aos casos de fator masculino alterado, mas atinge também as situações de fertilização em ciclo anterior baixa ou ausente. Além disso, executa-se a chamada ICSI preventiva, em que metade dos óvulos são submetidos ao processo de micromanipulação e o restante, ao processo de FIV convencional, especialmente nos pacientes com diagnóstico de infertilidade sem causa aparente ou que não engravidaram após 3 tentativas de inseminação artificial com esperma do marido. O esquema de estimulação ovariana preferencial é o de bloqueio da 2ª fase com acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) seguido FSH puro (Metrodin-HP, Serono). O controle do desenvolvimento folicular é executado apenas por ultra-sonografia vaginal, sendo realizada a administração da gonadotrofina coriônica humana, quando se observa um mínimo de 3 folículos com 17mm. Após a punção folicular por ultra-som vaginal, o líquido folicular é depositado em placas de cultura (Corning, New York). Em seguida, os oócitos são identificados e com o auxílio de pipetas Pasteur, transferidos para placas de cultura de Nunc (Roskilde, Denmark), contendo o meio de cultura IVF-50 (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden). Posteriormente, o complexo cumulus-corona é removido pela exposição em hialuronidase (80 UI/ml - Sigma Chemical Co., St Louis, USA) diluida no meio GAMETA-100 (Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden). O tempo de exposição na hialuronidase é variável, sendo os oócitos completamente desnudados através de sucessivas passagens em pipeta Pasteur estiradas. O procedimento de desnudação foi executado em placas de Nunc. Os oócitos desnudados foram incubados no meio IVF-50 até o momento da ICSI. Apenas os oócitos com o primeiro corpúsculo polar (metáfase II) foram injetados (Figuras 10.3 e 10.4).
As amostras de esperma foram coletadas por masturbação, aspiração cirúrgica do epidídimo ou por masceração do tecido de biópsia testicular. Em seguida, depositadas em placas de cultura (Corning, New York) mantidas na temperatura de 37º C. Após a liquefação, os materiais foram analisados em microscópio de contraste de fase, sendo a contagem dos espermatozóides executada na câmara de Makler (Sefi-Medical Instruments, Haifa, Israel). O critério de normalidade da amostra de esperma foi o estabelecido pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A separação dos espermatozóides do fluido seminal foi realizada através de gradientes descontínuos de Percoll (osmolaridade entre 280-290 mOsm/Kg H2O) preparados em tubos cônicos de 15ml (Corning, New York) com 1.5ml das frações de 40% e 90% de Percoll (diluições preparadas com meio IVF-50). Após centrifugação em 200g por 20 minutos, a camada de 90% e o sedimento, são transferidos para um novo tubo. e ressuspensos em 10 ml de IVF-50. Após nova centrifugação em 200g por 10 minutos, o sobrenadante é desprezado, e 1 ml de IVF-50 é adicionado ao sedimento. Nessa ocasião, a amostra de esperma é analisada, e estocada em cultura com CO2 a 5% até o momento do uso para ICSI. A ICSI foi realizada em um microscópio invertido Olympus IMT-2 equipado com um sistema de lentes Hoffman e acoplado com um micromanipulador automático MM-88. Os discos de cultura permaneceram na temperatura de 37º C, com o auxílio de uma placa de aquecimento (Swemed Lab, Västra Frölunda, Sweden). O controle da micropipeta (diâmetro interno de 4.8 um a 5.6 um, e externo, de 6.8 um a 7.6 um, com angulação de 30º C ) de transporte e injeção do espermatozóide foi realizado por micromanipulador hidráulico MO 202 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Uma micropipeta (diâmetro interno de 18 um a 25 um, e externo 80 um a 150 um, com angulação de 30º C ) foi usada para fixação do oócito sendo guiada para essa função por um manipulador MN-155 (Narishige Co, Tokyo, Japan). Os microinjetores usados foram do tipo IM6B (Narishige Co, Tokyo, Japan). O óleo mineral (Sigma Chemical Co, St Louis, USA) usado para evitar alterações importantes do pH no sistema foi lavado por duas vezes com água ultrapurificada (Sistema Milli-Q UF, Millipore CO, São Paulo, Brasil) e incubado com 10ml do meio de cultura Menezo B2 por uma noite, numa atmosfera com CO2 a 5% e temperatura de 37º C (tempo de conservação máximo : 7 dias). Em seguida, utiliza-se uma solução de polivinilpirrolidina (PVP, Scandinavian IVF Science AB, Göteborg, Sweden) (concentração de 10%, diluída em IVF-50) para a imobilização dos espermatozóides. A solução viscosa de PVP é produzida especialmente para o procedimento de ICSI, e testada previamente para a presença de DNA e endotoxinas. A solução de PVP foi estocada na temperatura de 4º C, até o momento do uso quando foi equilibrada na temperatura ambiente. Uma pipeta Eppendorf (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) equipada com ponteira estéril (Eppendorf-Netheler, Hamburg, Germany) não pirogênica, livre de DNA, RNAse e ATP, deposita um gota de 5 ul de GAMETA-100 no centro da placa de cultura e quatro gotas ao redor. As gotas devem ser cobertas imediatamente com óleo mineral pré-equilibrado para evitar evaporação. Antes de iniciar o procedimento de ICSI a gota central é removida, e substituída por PVP no volume de 5 ul. Posteriormente, adiciona-se uma pequena gota de esperma (1ul) no centro da gota de PVP. O espermatozóide é sugado na periferia da gota de PVP. Para a execução da ICSI, usa-se o aumento de 200 vezes. A micropipeta de ICSI deve ser posicionada na periferia da solução de PVP e um espermatozóide morfologicamente normal é imobilizado por passagens sucessivas na micropipeta e capturado por sucção para o procedimento. Alguns preconizam a quebra da cauda dos espermatozóides antes da sua injeção no ooplasma (Gerris e cols., 1995; Vanderzwalmen e cols., 1996). A micropipeta contendo o espermatozóide é removida desta gota e transferida para a gota que contém o oócito. O oócito deve ser delicadamente sugado com a micropipeta de fixação. O primeiro corpúsculo polar é posicionado na posição de 6 ou 12 horas e a micropipeta com o espermatozóide, introduzida horizontalmente na posição de 3 horas dentro do ooplasma. Uma gentil sucção é aplicada cuidadosamente para quebrar o oolema e evidenciar a presença de ooplasma dentro da micropipeta, confirmando a deposição intracitoplasmática do espermatozóide (não na invaginação do oolema). O espermatozóide imobilizado é inserido junto com o ooplasma sugado, com um mínimo de volume possível de PVP. A pipeta de ICSI deve ser delicadamente removida e o oócito liberado (Figura 10.5). Os oócitos injetados devem ser lavados em IVF-50 e transferidos para o novo IVF-50 suplementado com soro inativado da paciente a 10%. Os oócitos são observados após 16 a 18 horas do procedimento, para verificar a presença ou não de pronúcleos. O processo de fertilização normal é definido pela formação de dois pronúcleos distintos, seguido do aparecimento de clivagem embrionária após 24 horas da fertilização. Um máximo de 4 embriões são transferidos após 48 horas de cultura, sendo os excedentes criopreservados.
Resultados com ICSI realizado com espermatozóides obtidos no ejaculado
Em 1993a, Van Steirteghem e cols. compararam a SUZI com a ICSI num total de 300 ciclos de tratamento numa população de pacientes que não obtiveram fertilização ou apresentaram em ciclo prévio de FIV uma taxa de fertilização inferior a 50%. A técnica de ICSI lesou os oócitos numa porcentagem superior (13.5%) a obtida com SUZI (7.1%). Entretanto, a taxa de fertilização após ICSI (51%) foi superior a da SUZI (14.3%) em amostras com parâmetros semelhantes aos do esperma. O índice de clivagem foi idêntico em ambos os procedimentos (77%). A ICSI não está indicada na presença de óvulos imaturos. A fertilização é nula quando a técnica é realizada em óvulos com vesícula germinativa; nos óvulos imaturos, porém sem vesícula a fertilização foi de 9%. Por outro lado, os oócitos submetidos ao processo de FIV convencional e que não fertilizaram após 24 horas, mesmo em metáfase II, não apresentaram fertilização adequada quando se aplicou o método de ICSI tardio. Tsirigotis e cols. (1994a) injetaram 101 oócitos em metáfase II, não fertilizados após FIV, obtendo uma taxa de fertilização de 48%. Sjögren e cols. (1995) relataram índices de fertilização após ICSI de 36% em situação idêntica. Entretanto, com o uso de esperma fresco para a aplicação da ICSI após 24 horas, conseguiram uma taxa de fertilização de 56% e duas gestações de um total de 9 transferências de embriões, exclusivamente fertilizados por ICSI (Sjögren e cols., 1995). Novamente, Van Steirteghem e cols. (1993b) confirmaram o sucesso do uso da ICSI no tratamento de 150 pacientes que não conseguiram fertilização dos oócitos em ciclos prévios de FIV e/ou não foram aceitas no programa FIV convencional, pois não havia uma quantidade suficiente de espermatozóides. Um total de 1409 oócitos em metáfase II foram inseminados, sendo que 8.3% deles foram lesados durante o procedimento. Após 18 horas, 64.2% dos oócitos inseminados apresentaram pronúcleos. As taxas de fertilização não foram influenciadas pelas características do sêmen. Apenas 15 pacientes (10%) não tiveram embriões para transferência. O resultado final foi de gestação clínica por punção de 35.3% e por transferência embrionária de 39.2%. Na Austrália, Payne e cols. (1994) analisaram os resultados com os 100 primeiros casos de ICSI. O índice geral de fertilização foi de 71%, ocorrendo uma transferência de 2.6 embriões por ciclo. Obteve-se 30 gestações clínicas com um índice de 32% de gestações por transferência embrionária. A taxa de implantação foi de 15%. Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre as taxas de fertilização e gravidez nos pacientes com ocasionais espermatozóides no sêmen versus aqueles com concentrações baixas e insuficientes para o processo de FIV convencional ou os com concentrações normais, porém possuindo falhas em prévias tentativas de FIV. Os resultados confirmam os dados já referidos pela escola Belga, ou seja, a ICSI produz níveis de fertilização e de gravidez comparáveis aos obtidos no programa rotineiro de FIV com amostras de sêmen de pacientes normozoospérmicos. Na Inglaterra, Tsirigotis e cols. (1994b) realizaram a ICSI em 69 pacientes com longa história de infertilidade, sendo que 48 pacientes apresentaram falha de fertilização em ciclo anterior, 15 pacientes possuiam menos que 1 x 106 de espermatozóides no ejaculado e 6 casos eram de pacientes com azoospermia obstrutiva. Um total de 967 oócitos foram coletados, dos quais 785 foram micromanipulados (81%). Uma fertilização normal (2 pronúcleos) ocorreu em 52% dos casos. A transferência embrionária foi realizada em 64 casos, obtendo-se uma taxa de gravidez por punção de 36.2% e por transferência embrionária de 39%. O nível de implantação foi de 16%, sendo o índice de aborto de 24%. Van Steirteghem e cols. (1993b) apresentaram os resultados gerais com ICSI obtidos em 801 ciclos : 1 - oócitos injetados em metáfase II : 7907; 2 - oócitos intactos após o procedimento : 6994 (88.5%); 3 - oócitos com 2 pronúcloes : 4546 (65%); 4 -embriões transferidos 3465 (76.2%). A taxa de gestação clínica por ciclo foi de 35%. A relação entre o número de embriões transferidos e os índices de gestação clínica foi a seguinte : 1 - transferência de 1 embrião: gestação clínica em 6.30% dos casos; 2 - transferência de 2 embriões: gestação clínica em 22.2% dos casos; 3 - transferência eletiva de 2 embriões: gestação clínica em 30% dos casos; 4 - transferência de 3 embriões: gestação clínica em 34.6% dos casos; 5 - transferência de 4 embriões: gestação clínica em 38.6% dos casos. Por outro lado, Van Steirteghem e cols. (1994) analisaram os resultados do descongelamento e transferência de 413 embriões provenientes da técnica de ICSI. A taxa de sobrevivência após descongelamento foi de 53%, obtendo-se uma taxa de gestação clínica por transferência de embriões de 12.9% e um índice de parto por transferência de 5.9%. O nível de aborto foi de 40.9%, superior ao obtido na mesma ocasião com a técnica de FIV convencional (27%). A alta taxa de aborto pré-clínico após a transferência de embriões criopreservados provenientes da ICSI merece maiores estudos. Lundin e cols. (1994) descreveram na Suécia o sucesso na correção da infertilidade (parto gemelar) de um caso de globozoospermia (acrossoma ausente) com o uso da técnica da ICSI. Até então, essa rara doença genética tornava seus portadores definitivamente inférteis. A ICSI também mostrou resultados satisfatórios em outras alterações graves dos parâmetros do sêmen. Nagy e cols. (1994) verificaram a eficiência da ICSI em casos de criptozoospermia, astenozoospermia total e teratozoospermia total (100% de comprometimento). As taxas de fertilização e de gestação clínica nessas situações foram as seguintes : criptozoospermia (62% e 26%); astenozoospermia total (52% e 12%) e teratozoospermia (68% e 27%). A dificuldade na avaliação da vitalidade nos casos de astenozoospermia total poderia em parte ser solucionada com o emprego do teste hiposmótico. Vanderzwalmen e cols. (1994) também obtiveram resultados satisfatórios com o uso da ICSI em pacientes com infertilidade masculina severa do tipo astenoteratozoospermia. O índice de fertilização foi de 38%, com taxa de implantação de 12% e taxas de gestação clínica de 20% por ciclo e por transferência de 22%. Por outro lado, Soderlund e cols. (1994) verificaram que pacientes com amostras de sêmen com formas normais < 4% segundo o critério de Kruger, apresentaram taxas de fertilização e de gestação após a ICSI, semelhante as obtidas com o esperma de pacientes normais. Contudo, ocorreu uma alta incidência de abortamento espontâneo. Talvez o principal problema da morfologia espermática anormal não esteja na dificuldade de fertilizar, mas na produção de embriões de boa qualidade. A eficiência da ICSI em casos de oligoastenozoospermia moderada também foi comprovada. Aboulghar e cols. (1995) analisaram 53 pacientes com características do esperma "borderline" (concentração de espermatozóides entre 10 e 20 milhões por ml, motilidade entre 30% e 35%, formas anormais 50%). Em vista da possibilidade de falha total na fertilização dos oócitos pelo FIV convencional, optou-se pela aplicação da ICSI em parte dos oócitos gêmeos, sendo a FIV convencional utilizada nos restantes. Os resultados mostraram o acerto da decisão, desde que com a aplicação da ICSI a taxa de fertilização foi de 60% e não ocorreu falha total de fertilização. Entretanto, a aplicação de FIV convencional nos oócitos gêmeos mostrou uma taxa de fertilização de 18%, com falha total de fertilização em 49% dos casos. Calderón e cols. (1995) realizaram em pacientes com fator masculino alterado (concentração de espermatozóides < 20 milhões por ml e/ou motilidade < 50% e/ou morfologia normal < 14%) um estudo comparativo entre FIV e ICSI. Um total de 34 casais foram examinados, sendo a concentração de espermatozóides móveis para FIV convencional 0.5 x 106 ml por ml. Os oócitos gêmeos foram distribuidos de forma randomizada entre FIV convencional e ICSI em 27 pacientes (grupo I) que não apresentavam antecedentes de falha prévia na fertilização. Nos 7 casos restantes, com dados de falha (grupo II), um total de 65% dos oócitos em metáfase II foram oferecidos para ICSI e 35% para FIV convencional. No grupo I, a taxa de fertilização normal para a ICSI foi de 49.5% versus 19.5% para o FIV convencional. No grupo II, a taxa de fertilização normal para a ICSI foi de 51.9% contra 7.4% para a FIV convencional. Em conclusão, a ICSI deve ser o tratamento de escolha para o fator masculino alterado mesmo em ocasiões que os critérios mínimos para FIV convencional sejam preenchidos.
Resultados obtidos com a ICSI realizada com espermatozóides do epidídimo e do testículo
As duas principais causas de infertilidade masculina com espermatogênese normal são a agenesia congênita bilateral dos deferentes e a azoospermia obstrutiva sem possível correção cirúrgica. O protocolo básico para a solução destes casos consistia na aspiração microcirúrgica do epidídimo proximal e subseqüente aplicação da técnica de FIV. Algumas gestações foram obtidas com esse procedimento (Temple-Smith e cols., 1985), entretanto, a taxa de fertilização com espermatozóides obtidos do epidídimo era baixa e os índices de gravidez não excediam a 9%. Tournaye e cols. (1994) realizaram em 40 pacientes, com ausência congênita bilateral do ducto deferente, uma aspiração microcirúrgica do epidídimo acompanhada da ICSI. O índice de gestação clínica foi de 39% por ciclo de aspiração. Nesses pacientes, não houve correlação entre taxas de fertilização e evolução da gestação com seus fenótipos para doença fibrocística. Silber e cols. (1995) realizaram um total de 16 ciclos consecutivos de aspiração microcirúrgica do epidídimo e 12 ciclos com extração de espermatozóides do testículo, obtendo uma taxa de fertilização para o espermatozóide colhido do epidídimo de 45% e do obtido por biópsia testicular de 46%. Os índices de gestação em evolução foram de 50% e 43%, respectivamente. Concluindo que os espermatozóides obtidos do epidídimo ou do testículo comportam-se da mesma forma após a execução da ICSI quanto a fertilização dos oócitos e os índices de gravidez. Tsirigotis e cols. (1994c) descreveram os primeiros resultados com a técnica de aspiração percutânea do epidídimo (PESA), em que conseguiram colher por simples punção um número suficiente de espermatozóides para a aplicação posterior da ICSI. Em seguida, diversos trabalhos do mesmo grupo demonstraram a eficiência deste método na solução de casos de azoospermia obstrutiva (Craft e Shrivastav, 1994; Shrivastav e cols., 1994; Tsirigotis e cols., 1995; Craft e cols., 1995). Em 1995, Craft e Tsirigotis descreveram também a técnica de aspiração percutânea direta do testículo (TESA) através de agulhas de diâmetro de 21 a 23 "gauge". Dessa forma, introduziram-se métodos menos invasivos na tentativa de coletar os espermatozóides necessários para a realização da técnica da ICSI em pacientes com alterações importantes do fator masculino. No Brasil, Franco Jr. e cols. (1995a, 1995b, 1996) analisaram o uso da ICSI no tratamento da infertilidade masculina grave. Um total de 51 ciclos foram realizados, sendo colhidos 469 oócitos, com uma média de 9.2 ± 5.6 oócitos por punção. Além disso, 379 oócitos estavam em metáfase II (80%). Naquela ocasião, a taxa média de fertilização foi de 53.6%, com uma média de embriões transferidos de 3.16 ± 1.8. O índice de gestação por punção foi de 31.3% e por transferência de 34.7%. A taxa de implantação nessa população foi de 16.1%. Em cinco casos, em que os espermatozóides foram retirados do testículo, obteve-se após a ICSI uma taxa de fertilização dos oócitos de 45%, sendo a taxa de gestação clínica por punção de 60% (três gestações) e a taxa de implantação de 40%. As primeiras gestações no Brasil, obtidas com espermatozóides coletados do testículo foram produto do trabalho do Centro de Reprodução Humana da Fundação Maternidade Sinhá Junqueira. Devroey e cols. (1995) descreveram gestações após a retirada de espermatozóides do testículo em casos de azoospermia não obstrutiva e execução de ICSI. Um total de 15 casos foram realizados, obtendo-se espermatozóides em 13 pacientes, 182 oócitos em metáfase II foram injetados, obtendo-se uma taxa de fertilização normal de 47.8%. Uma taxa de gestação clínica de 25% e de implantação de 18% atestaram a indicação da ICSI nas azoospermia não obstrutivas. Kahraman e cols. (1996) realizaram biópsia testicular para coleta de espermatozóides em 16 casos de azoospermia obstrutiva (AO), e 16 casos de azoospermia não-obstrutiva (ANO). As taxas de fertilização na AO foi de 33.9% e na ANO de 65.3%, sendo as taxas de gravidez de clínica na AO de 43.7% e na ANO de 33.3%. As taxas de implantação elevadas foram obtidas tanto na A0 (30%) quanto na ANO (26%). Tournaye e cols. (1996) descreveram uma série de 124 pacientes que coletaram espermatozóides do testículo e realizaram ICSI. Todos os pacientes com diagnóstico anatomopatológico prévio de espermatogênese normal ou hipoespermatogênese apresentaram espermatozóides na preparação a fresco. O índice de recuperação dos espermatozóides foi de 84%, nos casos de parada de maturação ou de aplasia incompleta das células germinativas. A taxa de fertilização normal foi de 57.8%. A proporção de gravidez por procedimento foi de 39.5%.
Resultados com a ICSI realizada com o emprego de espermátides
Tesarik e cols. (1995) relataram o nascimento de crianças após a fertilização de oócitos com espermátides obtidas após o preparo do esperma (coleta na fração de 70% do Percoll), e introduzidas no ooplasma através da ICSI. Essa nova técnica de reprodução assistida poderá favorecer a solução dos casos de parada de maturação em espermátide. Fica claro que essa possibilidade teórica deverá ser acompanhada de uma rigorosa avaliação das condições de nascimento das crianças provenientes desta técnica.
Resultados da ICSI e o fator imunológico
Nagy e cols. (1995) referiram o uso da ICSI em 55 pacientes com níveis >80% de anticorpos antiespermatozóides pelo teste da reação de antiglobulina misturada (MAR). A taxa de fertilização normal foi de 75.7%, significativamente maior que a obtida em 1767 ciclos (taxa de fertilização de 69.2%) de ICSI executados na mesma ocasião, porém por outras indicações e com testes de MAR < 80% para anticorpos antiespermatozóides. Entretanto, a qualidade dos embriões cujos pacientes apresentaram teste de MAR positivo no esperma foi inferior àquela de pacientes com amostras apresentando teste de MAR negativo. Finalmente, obtiveram 26.4% de gestações clínicas e concluíram que a ICSI deveria ser o tratamento primário de escolha para os pacientes com fator imunológico com 80% de anticorpos antiespermatozóides. Por outro lado, Lähteenmäki e cols. (1995) compararam o tratamento por ICSI versus FIV convencional nos casais inférteis com anticorpos contra os espermatozóides. A taxa média de fertilização por ICSI (79%) foi superior à obtida por FIV convencional (44%), entretanto, a qualidade embrionária foi proporcionalmente inferior no grupo da ICSI.
As gestações após a realização da ICSI
Em 1996, Govaerts e cols. observaram que as gestações iniciais por ICSI não são diferentes das obtidas por FIV convencional quanto as taxas de aborto, perdas embrionárias intra-útero e gestações múltiplas. Bonduelle e cols. (1994) realizaram um estudo controle entre dois grupos de 130 recém-nascidos provenientes da aplicação da ICSI e do uso da FIV convencional. Os dados mostraram que não ocorreu diferença entre as malformações presentes nos dois grupos. No grupo da ICSI observaram-se cinco malformações importantes versus 6 no grupo da FIV. No grupo de ICSI, a média de peso para partos simples e gemelares foi de 3,279 Kg ± 0,582 e 2,605 Kg ± 0,431 respectivamente, e no grupo de FIV convencional, de 3,190 Kg ± 0.566 e 2,366 Kg ± 0.611. Recentemente, In't Veld e cols. (1995) relataram anormalidades nos cromossomas sexuais em 33% das pacientes (total de 15 casos) submetidas ao diagnóstico pré-natal por indicação de idade materna avançada. Por outro lado, Liebaers e cols. (1995) analisando 585 amostras (biópsia de vilosidade coriônica ou amniocentese) durante o diagnóstico pré-natal em pacientes submetidas à ICSI, observaram uma frequência de anormalidades cromossômicas de 1% (seis casos). Destes 5 foram de anormalidades sexuais (dois casos de 47, XXY; um caso de 47, XXX; um caso 47, XYY; um caso de mosaico 46, XX / 47, XXX; e o restante de trissomia do 21). Esses dados mostraram que realmente poderá ocorrer um discreto aumento de risco de anormalidades sexuais em crianças concebidas pela ICSI quando comparadas com a incidência na população geral ou aquelas submetidas ao diagnóstico pré-natal em virtude de idade materna avançada (Palo e cols., 1994). As anormalidades dos cromossomas foram observadas em quatro pacientes com a faixa etária entre 25 e 32 anos, e duas com idade de 41 e 44 anos (46, XX/47, XXX; 47, XY + 21). Por outro lado, de um total de 877 crianças nascida após ICSI, 23 delas apresentaram malformações maiores (2.6%) que levaram ao quadro de distúrbios funcionais ou necessitaram de cirúrgia. A incidência de malformações maiores foi similar a observada na população geral ou aquela verificada em crianças nascidas por outros procedimentos de reprodução assistida que não a ICSI. Os pacientes também deveriam ser informados da possibilidade de transmitir alterações nos genes reguladores da fertilidade, fato que poderia alterar a fertilidade dos seus descendentes (especialmente em casos de agenesia congênita do deferente). No mesmo problema, Hoegerman e cols. (1995) calcularam em 5% a possibilidade exagerada de alterações cromossômicas em casos de fator masculino severo, baseando suas conclusões na freqüência de alterações cromossômicas no homem analisadas pela técnica de fluorescência hibridação "in situ". Finalmente, as Tabelas 10.3, 10.4 e 10.5 apresentam nossos resultados atuais com a ICSI nas suas diversas indicações e usando-se os espermatozóides obtidos do ejaculado, epidídimo e testículo.
Tabela 10.3 - Resultados gerais do programa de ICSI
do Centro de Reprodução Humana da
Maternidade Sinhá Junqueira
Pacientes 225
Ciclos de punção 234
Idade das pacientes 31.9 ± 5
Oócitos coletados 9.7 ± 6.2
Proporção de fertilização 61%
Número médio de embriões transferidos 3.1 ± 1.7
Taxa de gravidez clínica por punção 32%
Taxa de gravidez clínica por transferência 35%
Taxa de implantação 16.5%
Partos por punção + gestações em evolução 29.4%
Tabela 10.4 - Resultados do programa de ICSI com
espermatozóides coletados do epidídimo
(janeiro de 1995 a outubro de 2001):
Ciclos: 175
Ciclos com coleta de oócito: 175
Idade feminina: 32.18+- 5.08
Idade masculina: 41.48+-7.81
Número de oócitos coletados: 11+- 6.56
Número de oócitos MII: 8.69+-5.05
Fertilização Normal: 60.15+-26.76%
Número de embriões transferidos: 2.8+-1.19
Taxa de gravidez clínica por punção: 29.14% (51/175)
Taxa de gravidez por transferência: 30.18% (51/169)
Taxa de implantação: 15% (72/480)
Tabela 10.5 - Resultados do programa de ICSI com
espermatozóides coletados do testículo
(janeiro de 1995 a outubro de 2001)
Ciclos: 118
Ciclos com coleta de oócito: 116
Idade feminina: 33.43+- 4.84
Idade masculina: 40.90+-9.25
Número de oócitos coletados: 10.21+-6.79
Número de oócitos MII: 7.79+-5.32
Fertilização Normal: 43.79+-31.45%
Número de embriões transferidos: 2.52+-1.14
Taxa de gravidez clínica por punção: 25% (29/116)
Taxa de gravidez por transferência: 29.59% (29/98)
Taxa de implantação: 14.98% (37/247)
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)