COVID-19 REDLARA: LIvros (Reproducción Humana e Infertilidad)
Diagnóstico Genético Preimplantacional
Iván Valencia Madera y Víctor Hugo Espín V. INTRODUCCIÓN CONCLUSIÓN REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
El diagnóstico genético preimplantacional (PGD) representa una alternativa al diagnóstico
prenatal y permite la selección de embriones sanos obtenidos por Fecundación In Vitro
(FIV) en parejas con alto riesgo de trasmitir un defecto genético1.
La biopsia del embrión y su análisis puede ser hecho en el ovocito/cigoto (estudio del
cuerpo polar)2, blastómeras de embriones en división (etapa de mórula)3, o blastocisto4. El
PGD puede ser usada para detectar enfermedades genéticas monogénicas o anormalidades
cromosómicas. Para llegar al diagnóstico se utilizan protocolos basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR)5; hibridización in situ fluorescente (FISH)6 e hibiridización
genómica comparativa (GCH)7, respectivamente.
El PGD es un procedimiento muy valioso en la Genética preventiva, especialmente para
parejas que tienen historia de problemas reproductivos y al mismo tiempo un alto riesgo de
trasmitir una enfermedad genética severa.
En los países del primer mundo, los problemas genéticos representan un tercio de todas las
admisiones a hospitales pediátricos y son una de las causas más importantes de mortalidad
infantil8. Aunque se ha concluido el borrador del Proyecto Genoma Humano y existen cada
día importantes avances en genética molecular9, la curación de problemas a partir de
terapia génica aún se encuentra en fase inicial10, lo que hace que la mejor medida para
controlar estas enfermedades siga siendo la prevención, siendo el diagnóstico prenatal o la
FIV con gameto donado alternativas para dichas parejas11.
El diagnóstico prenatal provee certeza diagnóstica en las primeras etapas del embarazo
basándose en la obtención de material fetal, siendo los métodos más utilizados muestras de
trofoblasto (biopsia de vellosidades coriónicas)12 o células fetales del líquido amniótico
(amniocentesis)13. Células fetales libres en la circulación maternal aparecen como una
futura fuente de obtención de material fetal de manera "no-invasiva", pero protocolos de
aplicación clínica aún no han sido establecidos.14,15 El principal inconveniente del
diagnóstico prenatal es la triste interrupción del embarazo si es que este se detecta afecto16;
y también está presente el riesgo de aborto existente por el procedimiento12,13.
El diagnóstico genético preimplantacional representa un procedimiento de “última
generación” en el cual se evita la terminación del embarazo gracias a que se identifican y
transfieren sólo embriones sanos obtenidos por (FIV). La posibilidad de llevar a cabo el
PGD fue inicialmente facilitada por el desarrollo de la reproducción asistida en los últimos
años 8017,18, conjuntamente con el descubrimiento de la reacción en cadena de la
polimerasa 5 Al momento han transcurrido más de 10 años desde que el primer embarazo
humano fue logrado luego de la biopsia y diagnóstico preimplantacional.19,20 y desde ese
2
entonces un buen número de centros a nivel mundial ofrecen este procedimiento21. Éste aún
no es ofrecido como un servicio clínico común, ya que, entre otras cosas, requiere un
trabajo multidisciplinario de expertos en los campos de medicina reproductiva y genética
molecular. Además, el diagnóstico genético en célula única es algo muy complejo, por lo
que protocolos muy exigentes deben ser seguidos de manera estricta.
FIGURA 1
El procedimiento de PGD requiere un sofisticado y oneroso equipamiento que permite que los
resultados obtenidos por el método de FISH sean correctamente interpretados. Debe incluir
microscopía fluorescente, filtros apropiados y software especializado. Tomado de Xangpu Xu59.
Obtención de células para PGD
Como se ha visto anteriormente, existen tres fuentes potenciales de células para realizar
PGD: Cuerpos polares del ovocito; blastómeras de embriones y células trofoectodérmicas
de blastocistos.
La experiencia del embriólogo es fundamental para asegurar una biopsia exitosa
manteniendo la viabilidad del embrión. El primer paso de cualquier biopsia consistirá en
realizar un agujero en la zona pelúcida que rodea al ovocito o al embrión. La penetración
utilizando el ácido Tyrodes fue el primer método utilizado 22,pero se encontró que la
biopsia con ácido Tyrodes podía afectar el desarrollo del ovocito, por lo que los métodos
mecánicos son los de elección 23. El más reciente avance en este campo es el uso de láser,
que aparentaría ser el método más preciso y seguro 24.
Biopsia de cuerpo polar
La biopsia de cuerpo polar fue inicialmente considerada muy ventajosa porque representaba
manipular ovocitos antes que embriones, evitando problemas bioéticos 25 proporcionando o
mayor seguridad, ya que el material de la biopsia no está destinado a formar parte alguna
del desarrollo embrionario.
3
a b
c d
FIGURA 2. Biopsia de cuerpo polar por técnica de micromanipulación : a)El ovocito es
situado por la pipeta de sujeción con el cuerpo polar en posición 12 horario. Una fina aguja de
disección de la zona pelúcida es utilizada para penetrarla en posición inter 1 y 11 horarios. b) La
aguja es empujada a través de la zona y junto al ovocito son movilizados por debajo de la pipeta de
sujeción. Delicados movimientos entre los dos microinstrumentos crean una apertura de la zona de
aproximadamente 1/5 de la circunferencia ovocitaria. También puede utilizarse solución de ácido
tyrodes o láser. c) El ovocito se reposiciona con la apertura con la apertura y su cuerpo polar a las 3
horarias; con una pipeta de aspiración roma (~20µm de diámetro interno) es utilizada para aplicar
una suave succión y extraer al cuerpo polar. d) Una vez removido el cuerpo polar puede ser fijado
para el análisis cromosómico por FISH o excluir defectos genéticos por PCR. Tomado de Xangpu
Xu 59.
Para el diagnóstico de enfermedades monogénicas esta técnica predice el genotipo del
ovocito. El resultado obtenido del estudio de la biopsia será el opuesto del ovocito. El
único problema que existiría sería una posible recombinación a nivel de la primera división
meiótica 2.
La biopsia de cuerpo polar puede ser utilizada también para detectar aneuploidías
cromosómicas en mujeres de edad avanzada 26o para casos en que la madre sea portadora
de una translocación cromosómica 27, pero en general el PGD no es utilizado para detectar
aberraciones cromosómicas21.
4
Biopsia de blastómera o embrión en etapa de división (Cleavage stage embryo )
Al tercer día de fecundación, el embrión fertilizado contiende 6 a 8 blastómeras28
(cleavage stage embryos). En esta etapa las células siguen siendo totipotenciales y el
embrión en si no está compactado. La calidad de los embriones en cultivo es muy variable
y pueden ser evaluados morfológicamente como grado I (correcta etapa de desarrollo,
forma regular de las blastómeras, sin fragmentación) a grado III (desarrollo lento,
blastómeras asimétricas, al menos una de ellas degenerada y un alto nivel de
fragmentación)29. Figura 3.
La biopsia de blastómeras de embriones en división es el método de elección en la mayoría
de centros que realizan el PGD.21,30. Desde su implementación esta ha ido perfeccionándose
como el uso de una misma micropipeta para realizar la disección y el aspirado 31,32; el uso
de láser 24, y de un medio de cultivo libre de calcio y magnesio para reducir la cohesión de
las células 33. La principal desventaja es la poca cantidad de material que se obtiene 34. Esa
es la razón por la que muchos centros que realizan PGD recomiendan realizar la biopsia y
el estudio de dos blastómeras en lugar de una 35, aunque este procedimiento podría
ocasionar pérdida en la calidad del embrión en desarrollo 21,29.
a b
c d
FIGURA 3. Biopsia de blastómeras por técnica de micromanipulación. a) La blástomera o
célula a ser biopsiada es localizada entre las posiciones 2 a 4 horarias. Un orificio u apertura de
diámetro necesario (20-25 µm) utilizando solución tyrodes se realiza con objeto de permitir el paso
fácil de la célula biopsiada. b) Mediante una micropipeta de biopsia con su extremo muy pulido,
5
diámetro interno de 45-55 µm y prellenada con medio para evitar una sobresucción accidental de la
blastómera ,lentamente es introducida a través del orificio o hasta la blastómera seleccionada,
misma que es extraída por suave succión. c)La blastómera es separada de sus células vecinas y
aspirada al interior de la micropipeta juntándose con el medio. Un núcleo de aspecto claro puede ser
visible. d) En lo posible deben ser biopsiadas dos blastómeras y analizadas independientemente para
incrementar la certeza de la PGD. Tomado de Xang Xu 59.
Biopsia de blastocisto
El blastocisto es una estructura cavitada que contiene aproximadamente 100 células con 5
o 6 días de existencia post-fecundación 28. La biopsia de blastocisto se ve más ventajosa ya
que el número de células que se obtiene es mucho mayor y, por lo tanto, la técnica es
menos compleja que la biopsia de blastómeras o de cuerpo polar. Las células del
trofoblasto no formarán en si parte del embrión, con lo que se evita problemas éticos y en el
desarrollo del embrión, 4 el problema reside en que en el mejor de los casos solo el 40-50%
de embriones desarrollan in vitro hasta esa etapa con los protocolos existentes.36,37
PROTOCOLOS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO
El diagnóstico a partir de una sola célula ha demostrado ser la parte más compleja, ya que
cualquier procedimiento tiene que ser completado en 48 horas para evitar comprometer la
viabilidad del embrión.
El PGD puede ser aplicado para problemas monogénicos o aberraciones cromosómicas
numéricas o estructurales. Con el PGD se puede diagnosticar cualquier problema genético
para el que existan protocolos pre-establecidos. Una de las mejores formas de optimizar
dichos protocolos es utilizar blastómeras de embriones remanentes luego de un ciclo de
FIV. La dificultad obvia es la limitada cantidad de células para experimentación. Pero a
pesar de esos obstáculos, protocolos muy eficientes han sido desarrollados y aplicados.38
PGD para enfermedades monogénicas
Protocolos para identificar enfermedades mendelianas en una sola célula se basan en la
capacidad de amplificar ADN a partir de la PCR 5,19. Obviamente el tener que trabajar con
una sola célula trae muchos problemas. Entre éstos se incluye la contaminación, la no
amplificación (falla de la reacción) y la pérdida alélica (ADO) [No se amplifica uno de los
alelos hasta niveles detectables]. Todos estos riesgos deben ser reducidos al mínimo antes
de iniciarse las aplicaciones clínicas.
La PCR para el análisis de una sola célula debe tener muchos más ciclos que lo usual, lo
que hace aun más peligroso la contaminación. Entre los potenciales contaminantes estarían
las células maternas que rodean el ovocito o un exceso de espermatozoides atrapados por la
reacción zonal. Por esta razón es muy recomendable realizar una disección muy detallada
del ovocito y el uso de la ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) en estos casos.21,30,39
Otras fuentes de contaminación incluyen naturalmente células de los investigadores y de
6
quienes realizaron el procedimiento de FIV/PGD, aplicaciones de PCR dentro del
laboratorio. Por estas razones, la biopsia y la PCR deben ser realizadas por separado, en
áreas diferentes, bajo condiciones muy estrictas y con uso de controles negativos en todos
los niveles.
La PCR debe ser optimizada para minimizar fallas y ADO. La mayoría de centros aceptan
un rango de 90% de amplificaciones y un 10 % de ADO 21,35,40. Factores que pueden influir
en el resultado son el método de lisis celular para la PCR, el segmento estudiado y el
tamaño del producto 41-43 y la obtención de material de mala calidad.44
La falla en la amplificación es un problema serio pero más grave aun es la ADO, ya que
puede conducir a diagnósticos errados. Por ello en la actualidad se encuentran
implementándose protocolos utilizando multiplex-PCR o PCR fluorescente 45,46.
PGD para anomalías cromosómicas
Las anomalías cromosómicas pueden ser detectadas también por el uso de técnicas de
citogenética fluorescente como la FISH (Fluorescence in situ hybridization) 6,47,48 y más
actualmente la hibridización genómica comparativa (GCH) 7,49,50, que logra una total
amplificación cromosómica, permitiendo visualizar todas las 46 interfases cromosómicas58.
El diagnóstico preimplantacional de anormalidades cromosómicas está indicado para dos
tipos de pacientes: mujeres de edad avanzada en programa de reproducción asistida o
parejas en las que uno de los miembros es portador de una translocación cromosómica
equilibrada.
En la Tabla I se resume las aplicaciones de la PGD, utilizando como herramientas
apropiadas de diagnóstico FISH y PCR58.
TABLA I. PCR versus FISH para diagnóstico de anomalías genéticas
PCR
Defectos monogénicos en enfermedades
autosómicas
Defectos de gen único en infertilidad
masculina
Identificación del sexo en enfermedades
ligadas al sexo*
FISH
Tamizaje de aneuploidías en mujeres de
edad reproductiva avanzada
Tamizaje de aneuploidías en infertlidad
masculina
Identificación del sexo en enfermedades
ligadas al sexo*
Abortos a repetición provocados por
padre portador de translocación
equilibrada
* Es preferible por FISH para evitar el riesgo de contaminación 58
7
La experiencia inicial de la PGD relacionada a la determinación de género de los embriones
como método indirecto de abolir enfermedades genéticas ligadas al cromosoma X presenta
ciertas particularidades. El uso de la PCR se ha visto disminuido por la alta posibilidad de
contaminación y un potencial diagnóstico erróneo. La FISH no presenta el problema pero
se halla limitada por problemas propios de la hibridización. Basados en datos limitados al
respecto se puede afirmar que la tasa de error para la determinación de género parece ser
menor al 1% 58 (Figura 4).
1 2
FIGURA 4. Célula masculina y femenina normales analizadas por la FISH
Tomado de Xang Xu 59
1. Célula normal XX. Cromosoma X con sonda FISH amarilla, cromosoma 16 con verde y
cromosoma 16 con color rojo
2. Células normal XY. Cromosoma X color amarillo, Y verde; cromosma 18 azul y 4 puntos de
los cromosomas 13 y 21
Aspectos prácticos y éticos
El desenlace exitoso de un proceso de PGD es el nacimiento de un niño saludable y sano.
Para llegar a este resultado final se debe pasar una serie de etapas en las que se incluyen el
proceso de FIV y el diagnóstico genético certero. Generalmente cerca del 70% de todos los
ovocitos recolectados serán fertilizados y aproximadamente un 70% de ellos se
desarrollarán hasta un estadio en el cual se podrá realizar la biopsia blastomérica, y entre
esas no todas se encontrarán en un estadio óptimo para el procedimiento. El PGD es exitoso
en cerca del 80-90% de embriones biopsiados y cerca de la mitad de ellos serán útiles para
la transferencia por no encontrarse afectados. El rango de embarazos que llegan al fin rara
vez sobrepasa del 30 % de todos los ciclos iniciados21, 51-53. Este relativamente bajo índice
de éxitos debe ser perfectamente discutido en asesoría genética a cualquier pareja que tenga
como opción un PGD. Además, para parejas sin problemas de fertilidad, una enorme
desventaja es el tener que ingresar al costoso programa de FIV. Aunque el PGD fue
iniciado como una alternativa al diagnóstico prenatal convencional (por la implicación de
8
interrupción del embarazo54), mas bien debería ser considerado como una opción para
parejas con alto riesgo de trasmitir alguna enfermedad genética severa y que además
presentan problemas de fertilidad.51, 52 o en parejas opuestas a la terminación de un
embarazo54.
La seguridad del estado de salud de los niños que nacen por el PGD es un aspecto muy
importante y al igual que al inicio de la FIV, la evaluación de los bebés nacidos por este
método hasta el momento indica que no ha existido ningún problema en su desarrollo
21,55,56.
El mayor temor en el PGD es un posible uso “eugenésico”57. Si bien los centros que
ofrecen el PGD sólo lo hacen para detectar el nacimiento de niños con problemas genéticos,
existe la posibilidad de que en algún momento alguno de estos ofrezcan el diagnóstico
preimplantacional del sexo, por lo que se hace fundamental establecer normativas bioéticas
en estos aspectos lo más pronto posible.
La posibilidad de excluir in vitro un embrión con documentadas anomalías genéticas antes
del inicio de la gestación, es una atractiva alternativa de prevenir enfermedades genéticas
de tipo hereditarias, preferible a los actuales métodos de Biopsia de Vellosidades
Coriónicas (CVS) en el primero, o amniocentésis en el segundo trimestre del embarazo en
curso. La ventaja de diagnosticar certeramente anomalías genéticas en el embrión elimina
del 25 a 50 % de riesgo de transferir un embrión afectado. El reporte conjunto58 de la
ASRM (American Society of Reproductive Medicine) y la SART (Society of Assisted
Reproductive Technologies) en junio del 2001 mencionan al menos 500 niños nacidos en
todo el mundo utilizando este procedimiento. Hasta la fecha no han sido publicados
estudios que revelen una mayor incidencia de tasa de malformaciones u otros problemas
identificables.
Su práctica implica una costosa inversión en personal calificado, equipamiento sofisticado,
laboratorio adecuado y gastos elevados para optimizar y realizar PCR y FISH. Todo lo
mencionado anteriormente hace que el proceso de PGD represente un costo adicional de
aproximadamente US$2.500 por ciclo de FIV o ICSI.
Aparece como una alternativa viable al diagnóstico genético postconcepcional y posibilidad
de una futura interrupción del embarazo. La frecuencia de potenciales casos para ser
aplicado PGD en la mayoría de centros especializados con seguridad se incrementará
cuando rutinariamente se ofrezca el FISH a mujeres en edad reproductiva avanzada con
objeto de descartar aneuploidías. Por el momento, este procedimiento se encuentra limitado
únicamente para ciertas enfermedades genéticas y a centros con alta capacidad en asesoría
genética, genética molecular y gran experiencia en embriología humana.
Es imperativo advertir a los pacientes sobre un potencial error diagnóstico y sobre
posibilidades, actualmente aún desconocidas, de consecuencias adversas a largo término en
fetos que fueron sometidos a un procedimiento de biopsia embrionaria. Se requiere todavía
9
adquirir equipamiento y metodología más certeras y eficaces y mejor experiencia en la
técnica antes de considerar la PGD como un examen bien establecido con indicaciones
específicas en la práctica clínica estándar.
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)