COVID-19 REDLARA: LIvros (Reprodução Assistida)
Fertilização In Vitro Convencional
Aspectos gerais
Em 25 de julho de 1978 teve início a era das técnicas de reprodução assistida com o nascimento de Louise Brown através do auxílio da fertilização "in vitro" (FIV) com subseqüente transferência intra-uterina de embriões (Steptoe e Edwards, 1978). O princípio básico que rege a aplicação das técnicas de reprodução assistida consiste em facilitar o encontro dos gametas para que ocorra a fertilização, tanto no organismo materno como no laboratório. Para isto, usam-se técnicas de estimulação ovariana, separação de espermatozóides, aspiração folicular e transferência de gametas ou embriões para o útero ou trompa. Em geral, na escolha entre as diferentes técnicas de reprodução assistida devem ser consideradas cinco variáveis : 1. idade da paciente. 2. história de infertilidade. 3. número de gametas ou embriões a serem transferidos. 4. habilidade da equipe com a técnica a ser utilizada. 5. condições laboratoriais do serviço. Atualmente, a tendência é caminhar para a escolha de técnica mais simples, de fácil realização e repetição ao nível ambulatorial, sem anestesia geral, com arranjos laboratorias menos complexos, com menor tempo de manipulação externa de gametas ou embriões e, é claro, com resultados considerados satisfatórios (Franco Jr. e Marinho, 1994). Habitualmente, as técnicas de reprodução assistida podem ser divididas em dois grupos : a- Técnicas não-invasivas : quando não ocorre a aspiração folicular, fazem parte deste grupo os diversos tipos de inseminação artificial que já foram descritas no capítulo 5. b- Técnicas invasivas : em que ocorre a captação de óvulos através da aspiração folicular. Em 1983, Tesarik e cols. descreveram duas gestações com o uso de uma técnica que consistia na colocação na trompa, no momento da sua reparação cirúrgica, de espermatozóides capacitados e óvulos. Em 1984, Asch e cols. publicaram idêntico procedimento porém com o emprego de laparoscopia ou minilaparotomia, denominando essa técnica de GIFT (transferência intratubária de gametas). Uma das condições para a aplicação desta técnica é a presença de pelo menos uma trompa permeável. Originalmente, a captação de oócitos era realizada por via laparoscópica e, no mesmo tempo cirúrgico, os oócitos captados são colocados dentro de um catéter já carregado com espermatozóides capacitados, sendo ambos introduzidos na trompa saudável. Uma das desvantagens dessa técnica seria a exigência de laparoscopia ou laparotomia para a cateterização tubária, maior tempo de anestesia geral, além de não ser possível saber se houve ou não fertilização. Hoje em dia, alguns grupos executam esse método empregando a ultra-sonografia vaginal para a coleta dos oócitos, sendo a transferência dos gametas, executada por via vaginal através de histeroscopia. Em seguida, Devroey e cols. (1986) descreveram a transferência intratubária de zigotos (ZIFT). Em 1987, Yovichi e cols. descreveram a transferência intratubária de embriões (TET) que basicamente é uma extensão das técnicas anteriores pela permanência dos embriões por tempo de aproximadamente 48 horas no laboratório, antes de serem transferidos por via laparoscópica para as trompas. Nos primórdios do seu desenvolvimento, a FIV visava corrigir os problemas de infertilidade das mulheres com lesões tubárias. Entretanto, com a simplificação da técnica e a melhoria dos resultados, tornou-se evidente que seus horizontes poderiam ser extendidos para outros casos de infertilidade, tais como, os de sem causa aparente, presença do fator imunológico, endometriose, aderências pélvicas e nas situações de comprometimento do fator masculino. Atualmente, a FIV convencional está indicada nas seguintes situações : 1. patologia tubárias : hidrossalpinge bilateral, ausência de trompas, falha de recanalização tubária pós-laqueadura. 2. endometriose (Chillik e cols., 1985). 3. infertilidade sem causa aparente (Salat-Baroux e cols., 1990). No momento, a indicação da FIV para a correção do fator masculino está sendo totalmente substituida pela injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Da mesma forma, indica-se a ICSI como a melhor forma de tratamento para o fator imunológico. Por outro lado, quando da indicação de FIV deve-se analisar as condições mínimas de aplicabilidade da técnica. Estas incluem a presença de pelo menos um ovário sensível aos esquemas de estimulação ovariana, um útero normal em termos de função, assim como uma amostra de sêmen que preencha os critérios mínimos de execução do procedimento.
O processo de FIV convencional
O processo de FIV convencional consiste de quatro etapas distintas : 1- Estimulação ovariana; 2- Aspiração folicular; 3- O processo de FIV em laboratório ; 4- Transferência de embriões para a cavidade uterina.
Protocolos de estimulação ovariana
As primeiras gestações obtidas com a técnica de FIV ocorreram após a captação ovular em ciclo natural. Entretanto, o ciclo natural apresenta desvantagens pela possibilidade de coleta de apenas um óvulo e a dificuldade na identificação do momento ovulatório. Soma-se a isso, as evidências de que um aumento progressivo das taxas de gestação possua uma relação direta com o número de gametas obtidos e, conseqüentemente, dos embriões transferidos (Laufer e cols., 1984). A estimulação ovariana teve início com o citrato de clomifeno e as gonadotrofinas. Em 1980, houve relato da primeira gestação com o emprego destas medicações (Trounson e cols., 1981). As gonadotrofinas, apesar de terem sido usadas por Steptoe e Edwards durante o fim da década de 70, somente em 1981, com o grupo de Norfolk houve a comunicação de gravidez com o emprego desta medicação (Jones e cols., 1982). Atualmente, protocolos usando essas drogas, isoladas ou associadas são procedimentos comuns nas diferentes unidades que trabalham com reprodução assistida. Na metade dos anos oitenta, a maioria dos grupos utilizava os esquemas convencionais com citrato de clomifeno, nas doses diárias de 50 a 100mg, durante um período de 5 dias, tendo início na primeira fase do ciclo menstrual (5º ao 9º dia ; 2º ao 6º dia, ou em outra seqüência). A principal gonadotrofina empregada era a gonadotrofina menopausal humana (hMG), composta de hormônio folículo estimulante (FSH : 75 UI) e hormônio luteinizante (LH : 75 UI), nas doses entre uma a três ampolas diárias ou a cada 48 horas . Em 1989, Kemeter e Feichtinger descreveram um protocolo convencional de estimulação ovariana que diferia dos anteriores que eram fixos (Frydman e cols., 1986), por usar uma pílula de baixa dosagem no ciclo prévio ao da FIV, mantendo um intervalo de 5 dias entre a parada da pílula e o início da estimulação ovariana com citrato de clomifeno, hMG e corticóide. Todavia, permitia-se uma variabilidade do dia de administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) em função da resposta individual de cada paciente (protocolo semiprogramado). No fim dos anos oitenta, a maioria dos centros empregavam análogos do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-a) associado com hMG nos protocolos de estimulação ovariana (Rutherford e cols., 1988; Meldrum e cols., 1989; Lejeune e cols., 1990). Os GnRH-a produzem uma elevação transitória na produção e liberação de gonadotrofinas, seguindo-se um bloqueio hipofisário com a manutenção da droga. Dessa forma, o ovário torna-se mais sensível ao emprego de hMG. O GnRH-a é utilizado em protocolo curto ou longo. No curto, inicia-se seu uso no 1º dia do ciclo menstrual, quando ocorre o efeito de "flare up" (descarga inicial de gonadotrofinas) que potencializa a administração exógena de hMG. No longo, o GnRH-a começa na metade da 2ª fase do ciclo menstrual ou no primeiro dia do ciclo, mas sempre empregado por um tempo mínimo de 14 dias. Como principal vantagem, os GnRH-a evitam a liberação precoce de LH endógeno, fato que potencialmente acarretaria falhas no processo de fertilização dos oócitos em cultura. Por outro lado, diversos trabalhos têm destacado a importância do emprego de GnRH-a associado com hMG como protocolo de rotina ou de primeira escolha para a estimulação ovariana em programas de FIV. A maioria dos estudos advogam uma superioridade do uso de GnRH-a + hMG sobre os regimes convencionais de estimulação ovariana. Entretanto, esses estudos tem sido retrospectivos e não randomizados (Rutherford e cols., 1988; Meldrum e cols., 1989; Lejeune e cols., 1990). Estudos prospectivos e randomizados comparando o uso de GnRH-a + hMG com protocolos convencionais de estimulação ovariana são escassos e de resultados contraditórios. Alguns (Neveu e cols., 1987; Ron-El e cols., 1991) relatam maiores taxas de gestação com o emprego de GnRH-a e hMG, outros não identificariam essa superioridade sobre os esquemas convencionais (Ferrier e cols., 1990; Maroulis e cols., 1991; Kingsland e cols., 1992, Harrison e cols., 1994). Apesar desta divergência, dois fatos destacam-se quando se usa análogos de GnRH-a e hMG : custo maior do tratamento e maior incidência da síndrome de hiperestimulação ovariana nas formas moderada e severa (Ron-El e cols., 1991). Em 1995, Daya e cols. demonstraram, num estudo de meta-análise, que para ciclos de FIV, o FSH está associado com um significante maior índice de gestação do que quando se emprega hMG. Atualmente, no Centro de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá Junqueira o acetato de leuprolide (Lupron, Abbott) associado com FSH-HP (Metrodin-HP, Serono) são usados como medicações de primeira escolha na estimulação ovariana para os programas de FIV convencional e de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). Inicia-se o bloqueio no 21º dia do ciclo menstrual anterior ao procedimento. Após 15 dias, desde que a menstruação tenha ocorrido, usa-se o FSH-HP (Metrodin-HP) na dose de 225 UI por dia durante 7 dias, no 8º dia começa o controle do processo de estimulação ovariana somente pela ultra-sonografia vaginal (Figura 7.1).
Em 1995, no Centro de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá Junqueira um total de 81 pacientes (idade média 31.5 ± 4.8 anos) cujos maridos apresentavam o fator masculino alterado foram submetidas a esse protocolo em nosso serviço. Uma média de 9.6 ± 6.3 oócitos foram obtidos, sendo que 7.1 ± 4.4 em metáfase II. Obteve-se uma taxa de fertilização dos oócitos após ICSI de 60%. O número médio de embriões transferidos foi de 3.2 ± 1.8, com uma taxa de implantação de 16%. O índice de gestação clínica nessa população foi de 37%, com uma taxa de aborto de 10%. A expectativa da obtenção de + 30% de partos por punção nesse grupo sugere uma alta eficiência do uso de FSH puro na estimulação ovariana para ICSI. Por outro lado, nas pacientes com baixo recursos econômicos usa-se um esquema denominado de semiprogramado (esquema de Viena) que consta de um bloqueio com anticoncepcional de baixa dosagem (etinil-estradiol 30 g e gestodene 75 g) desde o primeiro dia do ciclo menstrual precedente ao da estimulação ovariana e mantido por um período mínimo de 21 dias e máximo de 28 dias, sendo que a última pílula será tomada sempre numa segunda-feira. Obrigatoriamente, a estimulação ovariana terá início no 5º dia após o término da pílula (sempre num sábado), com citrato de clomifene na dosagem de 100 mg por dia durante 5 dias, FSH-HP (Metrodin-HP) na dose de 150 UI em dias alternados e dexametasona 0.5 mg por dia (Figura 7.2).
Franco Jr. e cols. (1995a) avaliaram o resultado do uso de ciclos semiprogramados para estimulação ovariana em 168 pacientes que realizaram um total de 207 punções para FIV convencional. Os fatores de infertilidade nessa população foram os seguintes : tuboperitoneal 65% dos casos, masculino puro ou associado 9.2%, endometriose 11.1%, ovulatório 4.3%, idiopático 11.6, diversos 2.4%. Não ocorreu captação de oócitos em 5 procedimentos (2.4%), obtendo-se um número médio de oócitos por punção de 5.87 ± 3.3. A taxa de clivagem embrionária foi de 60.2% ± 36.8, com transferência de pelo menos um embrião em 82.6% de todas as punções. O número médio de embriões transferidos foi de 2.52 ± 1.6. O nível de gestação clínica por punção foi de 23.6%. A taxa de gravidez clínica por transferência foi de 12.6%, a de parto por punção foi de 19.8%. A taxa de aborto foi de 16.3%. Não houve caso de hiperestimulação ovariana severa. Os resultados foram atrativos devido ao baixo custo das medicações quando comparadas com os esquemas de GnRH-a e gonadotrofinas. Nos ciclos estimulados surge um padrão polifolicular, criando-se uma nova situação hormonal diversa da fisiológica (monofolicular). A monitorização da resposta ovariana torna-se obrigatória para o sucesso do procedimento. Habitualmente, o crescimento folicular diário é acompanhado apenas por ultra-sonografia, dispensando-se as dosagens hormonais (Oliveira e cols., 1993). Em algumas situações, a determinação indireta dos níveis de estradiol pode ser obtida através da avaliação do número e tamanho dos folículos por ultra-sonografia usando-se a análise de equação de múltipla regressão (Franco Jr. e cols., 1993a). Geralmente, quando três ou mais folículos atingem 17 mm ou mais, desencadeia-se o processo de maturação dos oócitos pela administração de hCG na dose de 10.000 UI, sendo programada a captação ovular após 34 a 36 horas. Por outro lado, Oliveira e cols. (1993) estudaram a espessura e o padrão endometrial por ultra-sonografia no dia da administração de hCG em 100 ciclos com estimulação ovariana para FIV. Em 86 ciclos empregou-se uma estimulação ovariana com um esquema semiprogramado e nos 14 restantes, usou-se um com GnRH-a (acetato de leuprolide) na forma de bloqueio de longa duração seguido de hMG. A espessura endometrial foi significativamente inferior (p = 0.03) nos ciclos semiprogramados (8.8 ± 2.0 mm) do que a observada no grupo com análogo de GnRH (10.2 ± 2.0 mm). A distribuição dos padrões I (multicamada ou "3 linhas") e II (inteiramente homogêneo, hiperecogênico em relação ao tecido endometrial) em ambos os protocolos de estimulação não foram significativamente diferentes (p=0.91). A espessura endometrial no dia da administração de hCG no grupo padrão I ( 1= 8.9 ± 2.1 mm) foi similar (p=0.76) a observada no padrão II ( 2 = 9.0 ± 1.9 mm) Além disso, a espessura endometrial nas pacientes que engravidaram ( g= 8.5 ± 2.2 mm) não diferiu (p=0.22) das não grávidas ( ng = 9.0 ± 1.9 mm). Não houve diferença entre a incidência de gravidez nos grupos com padrão endometrial I e II (p=0.42). Em conclusão, os dados não evidenciaram um valor preditivo da gravidez pela análise ultra-sonográfica da espessura e da refringência endometrial no dia do uso de hCG em ciclos de FIV. A presença de fase lútea deficiente nos modelos de estimulação ovariana é um assunto controvertido. No que diz respeito aos protocolos convencionais com gonadotrofinas ou citrato de clomifeno (associados ou não) existem dúvidas sobre a necessidade de suplementação da 2 fase. No caso do emprego de GnRH-a, deve-se manter a fase lútea como rotina. Por outro lado, os esquemas de suplementação da fase lútea baseiam-se na administração de progesterona, hCG ou combinações dessas substâncias. A progesterona é usada na forma oral, vaginal ou injetável, sendo preferencialmente empregada nos casos de risco de síndrome de hiperestimulação ovariana (Baruffi e cols, 1991). A progesterona oral ou vaginal é administrada na dose variável de 300 mg a 600 mg por dia (Utrogestan), a injetável é usada na dose de 50mg por dia, todas iniciam seu uso no dia da transferência embrionária, e são mantidas durante 14 dias até a confirmação da gravidez. Por sua vez, a hCG é aplicado nas doses de 1000 UI no 4º , 6º , 8º e 10º dias após a transferência dos embriões.
Técnicas de coleta do gameta feminino
Os oócitos são colhidos pela aspiração individual de cada folículo, através de agulhas especiais. A intervenção é realizada cerca de 26 a 28 horas da detecção do pico de LH endógeno (ciclo natural) ou de 34 a 36 horas após a injeção de hCG (ciclos estimulados). Basicamente, no processo de captação dos oócitos dois métodos podem ser utilizados : a laparoscopia e a ultra-sonografia. A laparoscopia foi o método clássico introduzido pelos pioneiros da técnica de FIV. Habitualmente, requer anestesia geral e a prévia produção de pneumoperitônio, sendo para isso usado CO2 puro ou uma mistura de gases. Os ovários são apreendidos por pinças especiais, tracionados e manipulados de modo que cada folículo seja puncionado e o conteúdo folicular aspirado. Imediatamente, o fluido folicular coletado é examinado em microscópio para a identificação dos oócitos e seu grau de maturidade. Entretanto, a laparoscopia apresenta inconvenientes como a morbidade cirúrgica e anestésica, necessitando considerável aparato de suporte para sua realização. O processo é sempre complexo nas situações de aderências pélvicas extensas e obesidade. Em 1981, Lenz e cols. usaram a ultra-sonografia com guia para a agulha de punção, aspirando os folículos ovarianos por via percutânea e transvesical. Nessa ocasião, concluiram que as pacientes poderiam ser atendidas em regime ambulatorial, pois na maioria das vezes apenas uma sedação discreta e anestesia local eram suficientes para o processo de coleta dos oócitos. Além disso, a ultra-sonografia foi empregada com sucesso nas situações de aderências pélvicas severas que de princípio contra-indicavam o uso da laparoscopia. Naquela ocasião, os índices de recuperação dos oócitos giravam em torno de 57% por punção e não foram observadas complicações graves no ato, exceto hematúria transitória em 10% das pacientes. Em 1983, Wikland e cols. demonstraram que não ocorriam diferenças importantes entre a captação por laparoscopia (oócitos recuperados 86.4%, fertilizados 52%, transferência de embriões em 74% dos casos) e a executada por ultra-som (oócitos recuperados 93%, fertilizados 58%, transferência de embriões em 71% dos casos). Em 1985, Parsons e cols. iniciaram a coleta de oócitos por via peruretral. Nesse procedimento, a bexiga é cheia com solução salina e após a sondagem vesical, uma agulha é introduzida através da própria sonda dentro da bexiga, que é transfixada e a agulha penetra nos folículos ovarianos. O desconforto da repleção vesical e a hematúria, assim como a dor, após o procedimento, tornaram essa via pouco utilizada com o advento do transdutor vaginal (Feichtinger e Kemeter, 1986). Finalmente, a introdução da via vaginal tornou a ultra-sonografia o método preferencial (Franco Jr. e Serafini, 1985). A compressão do fundo de saco vaginal lateral e posterior pelo transdutor vaginal, permite que a agulha de punção aproxime-se do ovário, tal fato aumenta a eficiência do processo de coleta. A punção vaginal causa poucas complicações, exceto discretas perdas sanguíneas de origem vaginal no pós-operatório imediato ou incomuns descrições de infecção pélvica pós-punção.
O processo de fertilização "in vitro" em laboratório
Os oócitos colhidos são imediatamente transferidos para os meios de cultura. Os meios de cultura são constituidos por íons em concentrações próximas das encontradas no sangue, substratos energéticos, albumina e água ultra-purificada (Rinehart e cols., 1988). O tempo mostrou que as taxas de gravidez são independentes do meio de cultura utilizado, sejam aqueles produzidos no laboratório ou preparados para pronto uso. Nos serviços que preparam seu próprio meio de cultura, cuidados especiais devem ser tomados na obtenção de água ultra-purificada para diluição dos reagentes. Comumente, os meios de cultura são enriquecidos com fluidos biológicos, especialmente, o soro humano inativado (da paciente ou de um "pool" de soros do cordão umbilical). A experimentação animal e humana mostrou que os componentes do soro, ainda que inespecíficos são importantes para o desenvolvimento e aumento das taxas de clivagem de embriões "in vitro". As concentrações de soro no meio de inseminação (meio onde ocorrerá o contacto entre os espermatozóides e oócitos) variam de 7.5% a 20%. Em seguida, aumenta-se a concentração de soro para 20% a 40% no meio de crescimento onde são transferidos os oócitos já fertilizados (zigotos) e mantidos até as primeiras clivagens. Não há dados que demonstrem superioridade entre uma concentração ou outra de soro, tanto no meio de inseminação, quanto no de crescimento. O controle de qualidade de todos os componentes que participam ou entram em contacto com os gametas e embriões, é um dos aspectos mais importantes num programa de FIV. Um dos modelos biológicos mais simples para checar as condições do laboratório é o teste de sobrevida dos espermatozóides. Em geral, adiciona-se ou coloca-se em contato por algum tempo com o meio de cultura, os materiais que precisam ser testados. Em seguida, capacita-se os espermatozóides com o meio de cultura, com ou sem o fator problema, verificando-se qual é o número inicial de espermatozóides móveis em ambas as situações. Os materiais são incubados por 24, 48 e 72 horas na temperatura de 37º C, numa atmosfera com CO2 a 5%. Finalmente, a curva de sobrevivência dos espermatozóides (mínimo 50% em 24 horas) em função do tempo nos tubos de controle e experimental, definem a presença ou não de um elemento tóxico na cultura. Além do custo operacional baixo e fácil aplicabilidade, o teste de sobrevida dos espermatozóides fornece valiosas informações para a padronização laboratorial das técnicas de reprodução assistida. Franco Jr. e cols. (1993b) verificaram que o teste de sobrevida dos espermatozóides possui uma eficácia superior a de outros parâmetros do esperma (morfologia, concentração e motilidade) na previsão da fertilização dos oócitos em cultura. A maturação dos oócitos guarda uma relação direta com o complexo "corona-cumulus" (Marrs e cols., 1984). Durante o amadurecimento dos oócitos e a finalização do processo meiótico, o aglomerado de células de granulosa (cumulus) que os circunda, sofre um processo de dispersão, fato que assume uma importância prática como indicador indireto da evolução morfológica da maturação (Figura 7.3).
A maior parte dos serviços adota um intervalo de 4 a 8 horas após a coleta dos oócitos para realizarem a inseminação. Após o preparo do sêmen, sua concentração é ajustada para que o material inseminado possua um total de espermatozóides móveis entre 100.000 a 200.000 para cada oócitos. Cerca de 16 a 18 horas da inseminação, os oócitos são passados diversas vezes numa seringa de tuberculina com uma agulha de 27.5 G, de forma que as células da granulosa sejam liberadas e observa-se ao microscópio, a presença de dois pronúcleos (Figura 7.4).
Os pronúcleos são formações elípticas e simétricas, sendo que a distância entre os dois varia em função do tempo decorrido desde a fertilização. Inicialmente, os pronúcleos estão afastados e progressivamente aproximam-se até a fusão. Esse exame tem importância na detecção do fenômeno de polispermia, pela prevenção da transferência de embriões poliplóides (Figura 7.5). A verificação dos pronúcleos ocorre após 18 horas do processo de inseminação dos oócitos. Os aspectos morfológicos dos embriões humanos cultivados "in vitro", poderão, dentro de certos limites no momento da transferência, prever o aparecimento ou não de gestação. A imagem referida como "normal" define os blastômeros como de forma ovóide, de igual tamanho e sem fragmentações citoplasmáticas. Entretanto, não é incomum o encontro de blastômeros desiguais, resultando em clivagens assimétricas, porém com o desenvolvimento de gravidez e concepto normal. Mauri e cols. (1993) estudaram num programa de FIV, a relação entre a qualidade dos embriões transferidos e a taxa de gravidez. Um total de 119 ciclos de FIV foram analisados, sendo os embriões obtidos classificados em graus morfológicos segundo as características dos blastômeros (fragmentação, regularidade e número). Nas pacientes que engravidaram (n=34) o grau médio de qualidade dos embriões transferidos (4.2 ± 1.0) foi superior (p < 0.01) ao obtido (3.8 ± 1.1) para as que não engravidaram (n=85). Em conclusão existe uma forte correlação entre a qualidade dos embriões transferidos e a taxa de gravidez num programa de FIV.
Transferência de embriões
A transferência embrionária em fase precoce (zigoto ou pronúcleos) encurtaria a exposição dos embriões às condições de cultura "in vitro" e seus possíveis efeitos deletérios. Por outro lado, a transferência em estádios mais avançados ficaria mais próxima dos eventos fisiológicos, pois em curso natural, o embrião chega ao útero no estádio de divisão de 8 a 16 blastômeros. Habitualmente, os serviços de FIV procedem a transferência de um ou mais embriões em cerca de 48 a 72 horas do processo de captação dos oócitos. A maioria das transferências embrionárias uterinas são realizadas com a paciente em decúbito dorsal e sem qualquer sedação. Por outro lado, seria aconselhável identificar com antecedência o catéter ideal para a transferência. Em geral, não há diferenças significativas quanto à eficiência dos diversos catéteres usados em FIV. Assim sendo, mede-se a cavidade uterina em ciclos anteriores ao da captação e identifica-se qualquer dificuldade na passagem do cateter pelo canal cervical. Em princípio, a manipulação do colo uterino durante o processo deve ser evitada. Franco Jr. e cols. (1993c) testaram a hipótese de que a dificuldade no ato da transferência embrionária poderia alterar o índice de gravidez num programa de FIV. Assim sendo, um total de 79 transferências foram analisadas quanto à complexidade de execução e divididas em dois grupos : a. quando a transferência é considerada tecnicamente fácil (passagem cervical de cateter de Frydman sem resistência) : 52 casos; b. quando a transferência embrionária foi considerada difícil (necessidade de manipulação para a passagem de cateter de Frydman ou uso de cânula metálica) : 27 casos. O índice de gravidez no grupo A (32,69% por transferência) foi significativamente maior (p<0.05) do que no grupo B (11.11% por transferência). Assim sendo, esses dados sustentam a hipótese de que a dificuldade no ato da transferência embrionária reduz o índice de gravidez num programa de FIV. Uma questão importante no ato da transferência embrionária é a escolha do número ideal. Sabe-se que as chances de gravidez aumentam numa proporção direta ao número de embriões transferidos, mas adotando-se essa norma, eleva-se a probabilidade do aparecimento de gestações múltiplas que tradicionalmente estão associadas com uma maior morbidade fetal e materna (Franco Jr., 1994; Walters, 1996). A decisão sobre o número de embriões a serem transferidos deve levar em consideração diversos fatores, tais como a idade da paciente, a qualidade dos embriões, quadro clínico, existência de programa de criopreservação de embriões e principalmente a opinião do casal infértil. Azem e cols. (1995) referem que um número de seis ou mais embriões deveria ser transferido no grupo de pacientes que não conseguiram engravidar após 4 ou mais ciclos de FIV, afirmando também que na sua casuística não houve aumento nas gestações múltiplas. Franco Jr. e cols. (1995b) estudaram a possibilidade de um escore embrionário cumulativo (EEC), avaliado pelo número e qualidade dos embriões transferidos, prever a incidência de gravidez num programa de FIV. Um total de 293 transferências de embriões (TE) foram analisadas. No dia da TE (48 horas após a coleta de óvulos) os embriões foram distribuidos nos seguintes graus : Grau IV. blastômeros regulares e simétricos; Grau III. blastômeros irregulares ou menos de 10% de fragmentação; Grau II. de 10 a 50% de fragmentação dos blastômeros; Grau I. mais que 50% de fragmentação ou embrião em estágio de pronúcleo (Figura 7.6 e 7.6 cont.). Em seguida, o grau morfológico do embrião foi multiplicado pelo número de blastômeros para produzir um escore qualitativo para cada embrião. Os escores de todos os embriões transferidos por paciente foram somados para se obter o EEC para cada paciente. Um total de quatro grupos de escores cumulativos (EEC I : 10; EEC II : 11 a 26; EEC III : 27 a 50; EEC IV : > 50) foram estudados quanto a incidência de gestações clínicas. No EEC I foram realizadas 26 TE e não se observaram gestações (0%); no EEC II ocorreram 72 TE, com 10 gestações(13.88%); no EEC III foram feitas 118 TE, com 33 gestações (27.96%) e no EEC IV, um total de 77 TE, com 32 gestações (41.5%). As diferenças entre os quatro grupos foram significativas. O EEC baseado no número e qualidade dos embriões transferidos possui o poder de prever a incidência de gestação num programa de FIV. O diagnóstico da gravidez é realizado pela medida rotineira de ß-hCG plasmático após 14 dias da transferência dos embriões. Baruffi e cols. (1995) observaram que a medida quantitativa da ß-hCG no 14º dia após a transferência embrionária poderia predizer o curso da gravidez. As amostras de sangue de 48 pacientes que engravidaram no programa de FIV foram analisadas por enzimaimunoensaio (Serozyme, Serono). Em 23 casos de gestações únicas que evoluiram até o nascimento, a média dos valores plasmáticos de ß-hCG ( =265 153 mUI/ml) foi significativamente maior (p<0.05, teste Mann-Whitney) do que naquelas observadas em 12 gestações simples que abortaram ( =149 139 mUI/ml). Por outro lado, 13 gestações múltiplas que evoluiram até o nascimento, mostraram uma média dos valores plasmáticos de ß-hCG ( =435 130mUI/ml) significativamente superior (p<0.01, teste de Mann-Whitney) `as obtidas na população com gestação única. Os resultados sugerem que a determinação dos níveis plasmáticos de ß-hCG no 14º dia ou 15º dia após a transferência de embriões pode prever dentro de certos limites as populações com maior risco de abortamento e de gestações múltiplas. Glatstein e cols. (1995) acreditam que valores de hCG 135 mUI/ml e 220 mUI/ml dosados no 14º dia e 15º dia após a transferência embrionária, teriam respectivamente 94% e 80% de chance de prever sucesso no processo de implantação embrionária.
Rotina laboratorial para FIV convencional
A obtenção de resultados consistentes num programa de FIV depende de vários fatores, entretanto, a precisão do trabalho laboratorial é fundamental. Em seguida, descreve-se a rotina do procedimento de FIV no Centro de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá Junqueira :
Cuidados gerais no laboratório
A limpeza da incubadora deverá ser realizada cada 15 dias, usando-se álcool a 70%, sendo as partes internas esterilizadas em estufa. A cuba interna deverá ser preenchida com água ultrapurifica no volume de 6 litros para a manutenção da umidade relativa. Em seguida, a incubadora deverá ser estabilizada pelo período de 24 horas. Antes do uso, é obrigatório a observação da temperatura, umidade e da pressão de CO2.
Cuidados na véspera do processo de coleta de óvulos
Rever as condições de funcionamento da incubadora e limpar as bancadas e equipamentos com álcool 70%. Ligar e verificar o funcionamento dos microscópios e placas de aquecimento. Colocar o meio de cultura na incubadora para a obtenção do equilíbrio térmico e de pH. Conferir o material necessário para o procedimento de coleta dos gametas (agulha de punção, pipetas, seringas, placas, guia de punção ultra-sonográfica, etc).
Cuidados no dia da coleta dos gametas
Coletar o sangue da paciente (jejum) para o preparo do soro usado para o enriquecimento do meio de cultura. Montar a sala cirúrgica para a punção folicular por via ultra-sonográfica. Assepsia vaginal com solução de Ringer. Usar antibioticoterapia profilática (cefalotina 2g EV) após a captação dos oócitos. Lavar com meio de cultura a agulha descartável de punção folicular. Marcar os dados obtidos durante o processo de coleta dos gametas. Determinar o grau de maturação dos oócitos segundo a classificação descrita (Figura 7.8), utilizando-se como parâmetro de avaliação a relação corona-cumulus.
Preparo do soro
No dia da punção, retira-se sangue da veia cefálica do antebraço da paciente, num volume de 10 a 20 ml, com seringa descartável. Coloca-se o material em tubos de Corning de 15 ml (estéril). Centrifuga-se em 1000 g por 10 minutos para que ocorra a separação da parte sólida da líquida. Aguarda-se a retração do coágulo na temperatura de 37º C. O coágulo é comprimido com seringa de tuberculina acoplada com agulha, centrifugar, e separar o soro. O soro é transferido por inversão para um tubo cônico de vidro (borossilicato) lavado (com água ultrapurificada 20 vezes e, com escova retira-se os resíduos de soro e repete-se a lavagem após ferver. A esterilização do tubo é realizada em estufa na temperatura de 170º C por 120 minutos). Em seguida, o soro é inativado pelo calor na temperatura de 56º C por 45 minutos.
Enriquecimento do meio de cultura
O meio de inseminação é preparado com o meio IVF-50 (Scandinavian-IVF) e soro inativado da paciente a 10%. Adiciona-se o meio de inseminação em volume de 0.9 ml para cada lacuna da placa de Nunc, colocando-se de 1 a 3 oócitos por compartimento. O meio de crescimento é constituido de IVF-50 com soro inativado da paciente a 20%, os pronúcleos são transferidos para esse meio, onde permanecem até o momento da transferência embrionária.
Preparo do esperma
O esperma é coletado por masturbação (2 a 5 dias de abstinência sexual) em placa de cultura. Uma vez liquefeito, devem ser processado segundo as técnicas descritas no capítulo 4 (Usa-se como meio de cultura para capacitação dos espermatozóides o IVF-50, com soro inativado da paciente a 30%). Após o preparo, determina-se a concentração dos espermatozóides móveis em progressão linear. Ajusta-se a concentração entre 1 a 2 x 106 de espermatozóides móveis por ml, conservando-se o material na temperatura de 37º C e na atmosfera de CO2 a 5%. Os oócitos são inseminados com 100.000 a 200.000 espermatozóides móveis por ml, após 4 a 6 horas da coleta. Em casos de oligozoospermia grave e/ou astenozoospermia utiliza-se a técnica de inseminação intracitoplasmática (ICSI).
Observação da fertilização e transferência de embriões
A clivagem embrionária é comprovada entre 40 a 42 horas da inseminação dos oócitos. Geralmente, a limpeza dos oócitos é executada com passagens sucessivas em agulha 27.5 G de uma seringa de tuberculina. Os embriões devem ser classificados de acordo Steer e cols. (1992) segundo suas características morfológicas : Grau I - mais que 50% de fragmentação dos blastômeros ou embrião em estágio de pronúcleo. Grau II - 10 - 50% de fragmentação dos blastômeros. Grau III - blastômeros irregulares ou menos de 10% de fragmentação. Grau IV - blastômeros regulares e simétricos. A transferência deve ser realizada dentro de 40 a 42 horas de inseminação. Os embriões são colocados cerca de 0.5 cm abaixo da região fúndica do útero através de cateter, anteriormente lavado com meio de cultura. Nunca ultrapassar um volume de 50 ul. A transferência é realizada em decúbito dorsal, permanecendo a paciente nessa posição por três horas, antes de deixar o ambulatório. Não é aconselhado qualquer atividade física nas primeiras 24 horas e o ato sexual é suspenso até a determinação ou não da gravidez, apesar de cientificamente não existirem evidências definitivas para essas condutas. Apesar da impossibilidade de determinar o número ideal de embriões para a serem transferidos, o Centro de Reprodução Humana da Maternidade Sinhá Junqueira elaborou um protocolo que está em uso desde janeiro de 1996 (Tabela 7.1). Fica claro que a decisão final será do casal, após a exposição dos riscos de multiparidade para cada faixa etária e da situação clínica atual.
Tabela 7.1 - Número de embriões transferidos segundo a idade e o padrão morfológico
Idade (anos) Número de embriões
< 30 02 (Lote com 1 embrião grau IV)
03 (Lote sem embrião grau IV)
31 a 35 04 (Lote sem embrião grau IV)
> 36 a 39 04 (Independente do grau)
> 40 04 ou mais (Discutir cada caso)
Análise dos resultados e futuras possibilidades
Apesar das diversas formas de avaliação da eficiência das etapas que constituem o processo de fertilização "in vitro", na verdade os índices de gestação, especialmente o parâmetro denominado de "bebê em casa" (número de partos obtidos por ciclo de punção), é o dado de maior significado (habitualmente no valor médio de 15% por punção). As taxas de gravidez por punção variam entre os diversos serviços de reprodução assistida entre 20% a 30%, esse número é semelhante ao observado em ciclos naturais nas mulheres sem problemas reprodutivos (Franco Jr., 1985). O último Registro Latino-americano referente ao ano de 1993 revelou que foram iniciados 3620 ciclos de estimulação ovariana para FIV na América-Latina, realizando-se 3065 punções aspirativas. Um total de 2537 transferência foram executadas, resultando em 523 gestações clínicas, com 383 partos com pelos menos um recém-nascido vivo. Dessa forma, obteve-se um índice de cancelamento de ciclos de 15.3%, uma taxa de gestação clínica por punção de 17.1% e uma taxa de parto por punção de 12.5%. Por outro lado, o Grupo Internacional de Registro em Reprodução Assistida apresentou na França (Montpellier, setembro, 1995), durante o XV Congresso Mundial de Fertilidade e Infertilidade, os resultados mundiais referentes ao ano de 1993. Com relação ao programa de FIV analisou-se um total de 140477 punções aspirativas com transferência embrionária em 116617, obtendo-se uma taxa de gravidez clínica de 19.9% por punção e um índice de parto por punção de 14.8%. Em 1995, a Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva apresentou os resultados de FIV nos Estados Unidos referentes ao ano de 1993. Um total de 27.443 punções foram realizadas, obtendo-se 18.3% de partos por punção. A incidência de aborto foi de 19%. Atualmente, discute-se a possibilidade de pacientes com hidrossalpinge unilateral ou bilateral apresentarem taxas inferiores de gestação nos programas de FIV do que aquelas com salpingectomia bilateral. Kassabji e cols. (1994) comprovaram num programa de FIV que pacientes com hidrossalpinge apresentaram uma taxa gestação inferior e um alto índice de aborto quando comparadas com aquelas com salpingectomia bilateral. Entretanto, Sharara e cols. (1996) analisaram a performance no programa de FIV de 63 pacientes com hidrossalpinge e 60 sem essa lesão. As pacientes com títulos sanguíneos elevados para 'Chlamydia trachomatis" usaram antibióticos antes do procedimento de FIV. As taxas de implantação embrionária e de gestação foram superiores no grupo sem hidrossalpinge (12.6% e 33.7%) do que no com hidrossalpinge (9.8% e 24.8%), entretanto, a diferença não foi estatisticamente significativa. Apesar dos inúmeros progressos do programa de FIV, as taxas de implantação não se modificaram de forma significativa com o decorrer do tempo. Recentemente, Polak de Fried e cols. (1993) preconizaram o uso de regimes com altas doses de corticóides (metil-prednisona : 60 mg por dia, do dia da coleta de óvulos até um dia após a transferência dos embriões) com finalidade de aumentar a taxa de implantação de embriões não manipulados. Os resultados iniciais foram animadores, porém há necessidade de posterior confirmação por outros autores. Moffitt e cols. (1995) num estudo prospectivo, randomizado e duplo-cego usando doses baixas de glicocorticóides (6-alfa-metilprednisolona, na dose de 16 mg por dia, durante 4 noites iniciando na noite da coleta de óvulos) não observaram qualquer efeito positivo nas taxas de gestação. A micromanipulação dos embriões através de processo mecânico, químico ou laser, provocando uma abertura na zona pelúcida poderia aumentar as taxas de implantação embrionária (Cohen e cols. 1990; Strohmer e cols., 1992). Stein e cols. (1995) usaram a técnica de dissecção parcial da zona pelúcida em pacientes com falhas repetidas de implantação, observando que esse procedimento foi eficiente nas pacientes com mais de 38 anos e que relataram no mínimo 3 falhas de implantação em prévios ciclos de FIV (grupo de estudo : taxa de gestação de 23.9%; grupo controle : taxa de gestação de 7%). Por outro lado, alguns preconizam o uso de cocultura de embriões como uma forma de melhorar a qualidade dos embriões formados, reduzindo a fragmentação embrionária e aumentando as taxas de gestação e implantação (Thibodeaux e Godke, 1995). Do ponto de vista obstétrico, os níveis de cesariana giram de 47% até 56%, motivados em parte pela alta taxa de gestação múltipla, apresentações pélvicas em pré-termo, má história reprodutiva ou mesmo idade materna avançada. Não há predominância de sexo entre os recém-nascidos, os índices de relação sexo masculino e feminino variam em gestação única de 1.00 / 1.00, gêmeos 1.22 / 1.00 e triplos 0.88 / 1.00. A taxa de recém-nascidos de baixo peso é elevada (34.8%), estando associada com a multiparidade e prematuridade. A incidência de malformações fetais giram em torno de 2.3% porém não foram detectadas anormalidades específicas, sejam cromossômicas, ou não. Finalmente, as gestações oriundas de FIV apresentam uma maior incidência de prenhez ectópica e aborto espontâneo, do que a população geral. As complicações obstétricas decorrentes da multiparidade como a prematuridade e o baixo peso, também mostram uma maior frequência do que na população controle. O crescimento fetal na gestação, as malformações fetais e o rateio entre os sexos dos recém-nascidos não diferem aos da concepção natural.
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Glossário revisado da Terminologia das Técnicas de Reprodução Assistida (TRA), 2009. Comintê Internacional para Monitorização da Tecnologia Reprodutoiva Assistida (ICMART) e Organização Mundial de Saúde (OMS)