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REDLARA: O DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO E SUAS NOVAS INDICAÇÕES

Carmen Rubio, Sérgio Reis Soares, Lorena Rodrigo, Emilia Mateu, Amparo Mercader, José Remohí

Instituto Valenciano de Infertilidad (ICI - Valencia) Plaza de la Policía Local 3, 46015, Valencia, Espanha.

O impacto das alterações cromossômicas numéricas do embrião na capacidade reprodutiva.

A incidência na população geral de doenças resultantes de uma anomalia genética detectável é de 1-2% com predomínio das alterações cromossômicas sobre as gênicas. A maior parte das alterações cromossômicas (numéricas ou estruturais) são o resultado de erros repetidos que tem lugar durante a gametogênese de individuos com cariotipo normal, especialmente freqüentes na espécie humana (1-3). A incidência de aneuplodia nos embriões pré-implantatórios, estimada desde embriões obtidos de ciclos de reprodução assistida, varia de 20% a 70%, segundo os diferentes autores (4-7). Um processo de seleção negativa dos embriões cromossomicamente anormais determina que, no momento da detecção clínica da gravidez, a freqüência de aneuploidia já tenha baixado a 5,5% , e ao nascimento a 0,3% (8). Como evidência de tal seleção negativa, de 50 a 70% dos abortos espontâneos (2,9-12) e 6% dos natimortos (13) apresentam alterações cromossômicas. Mais recentemente, com o análise das velosidades coriais, se tem visto que a porcentagem referente aos abortos pode aumentar até 83% (14).

Com a introdução do diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) e da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) nos laboratórios de reprodução assistida, têm-se realizado numerosos estudos que parecem indicar que a referida seleção negativa tem seu início antes da implantação, no período compreendido entre a fecundação e o desenvolvimento embrionário até blastocisto. Durante esse período, os embriões portadores de determinadas anomalias cromossômicas degenerariam ou seriam obstruídos em fases iniciais do seu desenvolvimento. A relação das anomalias cromossômicas com a morfologia embrionária também tem sido estudada. Almeida et al. observaram que embriões humanos classificados como de pior morfologia apresentavam maior incidência de anomalias cromosômicas e de bloqueio do desenvolvimento in vitro (15) e Pellestor et al, encontraram maior incidência de anomalias cromosômicas em embriões muito fragmentados (grau IV) (16).

Nosso grupo analisou a influência de determinadas anomalias cromossômicas na capacidade de desenvolvimento até o estado de blastocisto. Encontramos que a porcentagem de embriões cromossomicamente normais que chegam ao estado de blastocisto é significativamente superior à dos embriões com anomalias cromossômicas (54,4% vs 33,6%), respectivamente). Porém, estes dados também confirmam que a seleção negativa dos embriões cromossomicamente anormais no período pré-implantatório não é absoluta e depende do tipo de anomalia cromossômica: as trissomias e os mosaicismos não tiveram um efeito deletério sobre o desenvolvimento embrionário, já que 6,0% e 56,8% destes embriões, respectivamente, chegaram ao estado de blastocisto, frente a 29,8% dos embriões monossômicos (predominantemente 
as monossomias X e 21, com 20% e 55% de chegada ao blastocisto respectivamente). As monossomias autossômicas, muito raramente encontradas nos abortos espontâneos, devem ser responsáveis pelas perdas embrionárias pré-clínicas (10,11,17). Magli e colaboradores encontraram 40% de blastocistos com anomalias cromossômicas. Além disso, Munnet et al. (20) observaram que nos embriões com boa morfologia, as aneuploidias aumentam com a idade.

O diagnóstico genético pré-implantacional no contexto clínico

Durante os últimos anos, têm-se desenvolvido técnicas que permitem a análise cromossômica de células isoladas do embrião antes de que este seja transferido ao útero materno. Nisto consiste o diagnóstico genético pré-implantacional mediante a técnica de FISH, que abordaremos aqui.

Então, depois do tratamento do FIV, realiza-se a biópsia embrionária na qual extraem-se uma ou duas células embrionárias (os blastômeros) que são analisados posteriormente. Esta técnica é de grande interesse para aqueles casais com risco elevado de transmissão de anomalias cromossômicas por descendência.

A metodologia

Biópsia embrionária e fixação dos blastômeros

Realiza-se a biópsia embrionária no terceiro dia do desenvolvimento in vitro, quando os embriões têm entre 6 e 8 células. A retirada de um número de células correspondente à quarta parte da massa embrionária neste momento não tem implicações significativas no desenvolvimento embrionário até o estado de blastocisto, nem a capacidade para proceder ao hatching (21). Os blastômeros são extraídos mediante o método de aspiração depois de realizar um orifício na zona pelúcida com a solução ácida de Tyrode. Extraem-se um ou dois blastômeros nos quais pode-se ver (prévio ao retiro) um núcleo interfásico único no seu interior. A técnica de FISH requer que o núcleo se extenda a um porta-objetos previamente desengordurado, com a precaução de eliminar por completo os restos de citoplasma que podem ficar ao redor e de conservar a integridade e morfologia do núcleo.

A hibridação in situ fluorescente (FISH)

A FISH permite quantificar as cópias de cada cromossoma presente em uma célula. Para isto, utilizam-se sondas com uma seqüência de bases complementares especificamente a uma seqüência de DNA do cromossoma em concreto que queremos valiar. Estas sondas estão marcadas com fluorescência e em determinadas condições vão hibridar com o DNA do núcleo que queremos analisar. A molécula do DNA tem forma de dupla hélice, portanto, para permitir que as sondas se unam ao DNA embrionário, procede-se a separação das duas fitas que formam a molécula. Logo, durante o processo de separação, a sonda de DNA une-se à seqüência complementar que se encontra no DNA do blastômero. Já que as sondas estão marcadas com um fluorocromo, as amostras serão examinadas com um microscópio de fluorescência utilizando filtros adequados, que nos permitem identificar as marcas fluorescentes do núcleo.

As seqüências das sondas mais utilizadas podem ser de três tipos:

Seqüências a-satélite altamente repetitivas, que normalmente se encontram localizadas nas regiões centroméricas dos cromossomas. São as utilizadas normalmente para os cromossomas X, Y, 16 e 18). 
a) Seqüências específicas de locus com uma ou muito poucas cópias. Este tipo de sondas dão sinais muito mais pontuais. Deste tipo são as sondas para determinar as aneuploidias dos cromossomas 13, 21 e 22. 
b) Seqüências sub-teloméricas que nos permitem analisar os telómeros ( do braço curto ou do braço comprido) de praticamente todos os cromossomas. Este tipo de sonda nos permite o estudo indireto de praticamente todas as translocações e investimentos.

As anomalias que se observam com maior freqüência nos abortos espontâneos são as trissomias dos cromossomas 16, 21 e 22, a monossomia do cromossoma X (11.4%), a triploidia (6.3%) e a tetraploidia (3.8%) (14). Em recém-nascidos, as aneuploidias mais freqüentes são as trissomias dos cromossomas 21, 18 e 13 e as aneuploidias dos cromossomas sexuais. Nesta qualidade, nos casos de PGD por risco de alterações cromossômicas numéricas estudamos de maneira rotinária nos blastômeros biopsiados o número de cópias dos cromossomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. Alguns grupos incluem também neste estudo aos cromossomas 1, 14, 15 e 17 (22-24).

Indicações do PGD 
Depois dos primeiros casos publicados (25), as indicações mais consolidadas do PGD de anomalias cromossômicas têm correspondido a: 
1. os casos de doença com padrão de herança ligada ao sexo (26-28) 
2. as situações nas quais o incremento do risco de produção de embriões com desequilíbrio cromossômico numérico ou estrutural estava claramente documentado: portadores de alterações cromossômicas numéricas ou estruturais (29-32) e idade materna avançada (33,34).

Por outro lado, recentemente caraterizaram-se outras duas situações nas quais uma produção elevada de embriões com alterações cromossômicas numéricas pode, ao menos em alguns casos, ser a responsável pela dificuldade em obter uma gravidez a término.

Abortos de repetição (AR) em casais com cariotipo normal.

Os AR (dois ou mais abortos prévios consecutivos) afetam até 1% dos casais em idade reprodutiva (35). Dois fatos apoiaram à consideração de dita situação como uma possível indicação de PGD: em primeiro lugar, depois da realização de um protocolo de pesquisa adequado, aproximadamente 50% dos casos seguem sem uma etiologia definida (36, 37). Exemplo, só 4,7% destes casais estão compostos por um membro portador de uma alteração cromossômica estrutural equilibrada (1). Em segundo lugar, as alterações cromossômicas numéricas são responsáveis por uma elevada percentagem dos abortos do primeiro trimestre.

Baseado nestes fatos, iniciamos em 1996 um programa de PGD para pacientes com AR. Tinhamos o objetivo duplo de elucidar se um aumento na incidência de alterações cromossômicas em embriões pré-implantatórios seria a explicação dos abortos repetidos nestes casais e de medir o impacto da técnica nos resultados dos ciclos de reprodução assistida, mediante a seleção de embriões euploides para transferência à cavidade uterina. Utilizamos para o PGD sondas para os cromossomas 13. 16, 18, 21 22, X e Y.

Foram incluídos os casais com dois ou mais abortos, nos quais detectou-se a causa dos abortos depois da realização do protocolo diagnóstico de AR: ecografia vaginal e HSG/histeroscópia, níveis basais de FSH, LH, PRL, TSH e glicose, perfil para trombofilia (níveis plasmáticos de antitrombina, proteína S e C, e anticorpos antifolsfolípedes) e cariotipo do casal.

Nos resultados acumulados obtidos ao longo destes anos, temos que o PGD por AR foi indicado para 71 casais, com a realização de 86 ciclos de estimulação ovariana. Em 19 ciclos (22,1% do total), todos os embriões analisados foram considerados anormais e não houve transferência, enquanto que nos outros 67 ciclos foram transferidos uma média de 1.5 ± 1.0 embriões, com a obtenção de 23 gestações (taxa de gestação de 34,3%). Dez destes resultaram no nascimento de 13 recém-nascidos, nove ainda estão em evolução (já passadas as 20 semanas), uma foi uma gravidez ectópica e três terminaram em aborto, reduzindo a taxa de aborto nestes casais a valores 
próximos aos observados na população em geral (13% vs. 15%), respectivamente).

Inclui-se um grupo controle composto por 28 casais cuja indicação de PGD foi uma doença com herança ligada ao sexo. Realizaram-se 35 ciclos, com 31 transferências embrionárias e uma taxa de gravidez de 29%, similar a do grupo de pacientes com AR.

A freqüência de embriões cromossomicamente anormais foi significativamente superior no grupo estudado, quando comparada com a do grupo controle: 70,7% vs 45,1% (p<0,0001). Concretamente a freqüência de aneuploidia também foi superior no grupo estudado (56,5% vs. 33,9%; p< 0,001), exclusivamente devido a um aumento nas pacientes com idade inferior a 37 anos.

Comparando nossos dados com os do ESHRE Consortium, pode observar-se que temos encontrado uma porcentagem mais elevada de embriões cromossomicamente anormais (70,7% vs. 55,7%), que as taxas de gravidez por transferência são similares (34,3 % vs. 31,6%) e que o número médio de embriões transferidos por nós foi inferior (1,5 vs. 2,2).

Além disso, temos constatado que 22% dos casais com AR tem 100% dos embriões con anormalidades cromossômicas e que a porcentagem de embriões anormais em ciclos sucessivos de FIV em casais com AR é bastante constante. Tais fatos determinam que, nestes casos concretos, o PGD ainda que não resulte de utilidade terapêutica, tem um valor diagnóstico fundamental, de grande ajuda no estabelecimento de outras opções de tratamento.

Os 3 abortos que observamos depois do PGD demostram que não podem descartar outros cromossomas não estudados por nós como potencialmente implicados em abortos (1&), em outras possíveis causas genéticas com uma tendência repetida à perda de gestações de embriões masculinos. Sabemos que a inativação não aleatória do cromossoma X foi descrita em mulheres com AR, o que sugere que elas poderiam ser portadoras de mutações letais ligadas ao cromossoma X, que determinaria uma menor freqüência de filhos masculinos nestes casais. (38). Microdeleções não detectadas no cromossoma X também poderiam determinar uma situação similar (39). Naturalmente, muitos outros fatores ainda desconhecidos poderiam também ser os responsáveis de alguns casos de AR.

Pacientes com falhas repetidas de implantação

A falha de implantação (FI) define-se como a ausência de gravidez depois de três ou mais ciclos de reprodução assistida com transferência de um bom número de embriões de boa qualidade. Fatores associados ao embrião e ao endométrio são os possíveis determinantes desta condição e ainda carecem de uma definição mais exata. Neste contexto de imprecisão etiológica, as opções terapêuticas tendem ser controvertidas. Até hoje, têm-se oferecido aos casais com FI, o hatching assistido, o criopreservação de embriões e o PGD.

Alguns grupos tiveram bons resultados com a utilização do hatching assistido (40), enquanto que outros não tem observado utilidade no método (41).

O cultura embrionária até o estado de blastocisto tem sido utilizado como um instrumento capaz de selecionar os embriões com maior possiblidade de implantação. Temos observado que esta abordagem pode ser interessante em casos de FI em pacientes submetidas a ciclos de doação de óvulos, mas não para os ciclos com óvulos próprios (42). Por outro lado, tem-se descrito uma queda marcada das taxas de implantação e gravidez em ciclos repetidos de transferência de blastocistos (43).

Neste contexto, o PGD constitui-se em uma proposta vantajosa com relação às outras mencionadas, na medida que carrega informação diagnóstica da possível etiologia do FI. Estudos recentes tem demonstrado que casais com FI produzem embriões com alterações cromossômicas numéricas com uma freqüência estatisticamente superior aos do grupos controle. Além disso, o número de ciclos de reprodução assistida realizados parece predizer de maneira linear a taxa de embriões com cariótipo anormal: tanto que em casais com 2 ciclos frustrados de FIV a taxa de embriões anormais situa-se ao redor de 40%, este valor chega a 50% no grupo com duas tentativas de FIV e a 67% em casais com mais de 5 ciclos de FIV sem gravidez (44,45). As anomalias cromossômicas encontradas nestes embriões são predominantemente os mosaicismos, as monossomias e as poliploidias. (6). Estes autores relatam uma razão monossomia/trissomia de 3,5. Temos observado também um predomínio, mais direto, das monossomias sobre as trissomias (1,6). Tal predomínio pode explicar em parte, as falhas de implantação nestes casais. Um aspecto importante que devemos ver é que a elevada porcentagem de embriões com alterações cromossômicas que chegam a blastocisto em cultura in vitro (até 34%) (46,47) deixam claro a limitação da cultura prolongada como método de seleção dos embriões normais para a transferência.

Em relação à aportação terapêutica do PGD os casais com FI, Gianaroli et al, relatam taxas de implantação e de gravidez similares neste grupo de pacientes submetidos ao PGD e no grupo controle submetido ao hatching assistido (6).

Em nosso centro, têm-se realizado 47 ciclos de reprodução assistida + PGD em casais com este diagnóstico. As taxas de implantação e gravidez foram de 18,8% e 32,4% respectivamente. A idade teve uma importante influência no êxito do tratamento, tendo melhores resultados os casais compostos por mulheres mais jovens.

A porcentagem de embriões cromossomicamente anormais diagnosticados por nós (69,2%), mais do dobro do observado no nosso grupo controle, é similar ao descrito por ESHRE Consortium (60,8%). Porém, nossa taxa de gravidez foi marcadamente mais elevada que a relatada pelo Consortium (32,4% vs. 11%), com uma média de embriões transferidos similar. Chama a atenção o número de casos de gestações bioquímicas descritas pelo Consortium: 12 de 20 gestações não chegaram ao estado de detecção clínica. Na nossa série, somente 3 de 15 ciclos com B-hCG positiva não chegaram ao estado de detecção clínica. Achamos que a diferença observada na porcentagem de perdas precoces pode ser devido, ao menos em parte, à associação de dois fatores : a elevada freqüência de mosaicismos nos embriões destes casais (44,45), e a prática rotineira no nosso centro de biopsiar dois blastômeros sempre que possível. Dado que em muitos centros biopsia-se somente um blastômero, nossa possibiidade para diagnosticar mosaicismos seria superior, o que contribuiria à seleção dos embriões cromossomicamente normais, diminuindo o risco de perdas pré-clínicas. No entanto, se para um futuro precisasem estudos prospectivos randomizados para esclarecer a eficacia da seleção de embriões cromossomicamente normais em casais com falhas repetidas de implantação e também para valorizar que cromossomas poderiam estar realmente implicados na falha de implantação e portanto deveriam estar incluídos nestes estudos (48).

Conclusões

Nossos dados reafirmam de maneira categórica que casais com AR e FI produzem embriões com alterações cromossômicas numéricas com uma freqüência superior dos casais sem estes problemas. Além disso, muitas destas anomalias cromossômicas ( principalmente as trissomias, a menossomia X e s mosaicismos) são compatíveis com o desenvolvimento in vitro, o que lhe assinala ao PGD um papel diagnóstico e terapêutico que , porém, só terá seu verdadeiro impacto definido depois da realização de estudos prospectivos randomizados nos quais um número suficiente de casais com as indicações aquí abordadas sejam estudados.

Além destas considerações , devemos saber as limitações atuais do PGD. O número de embriões que podem ser analisados en cada caso é determinante dos resultados do PGD, já que com poucos embriões ( menos de 6) (49) as expectativas de transferência e gravidez se reduzem consideravelmente. Condições associadas a uma baixa resposta ovariana podem não se beneficiar do papel terapêutico do PGD. Por outro lado, devemos levar em conta a repercussão do mosaicismo em um possível erro diagnóstico. Em nosso programa de PGD, em aqueles embriões nos quais realizamos dois blastômeros, encontramos 15% dos embriões com resultados discordantes entre as duas células, então em caso de gravidez sempre deve recomendar-se a amniosíntese.

A possibilidade de que qualquer cromossomo esteja envolvido nas alterações numéricas demonstra que novas tecnologias, como talvez a hibridação genômica comparada (50), são necessárias à valiação de toda a dotação cromossômica da célula e também se estabelece a interessante questão sobre a qual seria a verdadeira incidência de anomalias cromossômicas em embriões humanos desenvolvidos in vitro se todo o cariotipo fosse analisado.

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Dr. José Remohí

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